Толщина осп: Список всех толщин, форматов и производителей плит OSB | ООО «Строй-Провайдер»

25. Название какой болезни, которую можно предотвратить с помощью вакцин, происходит от греческого слова, означающего «кожаная шкура»?

1. Дифтерия
2. Столбняк
3. Коклюш (коклюш)
4. Краснуха

Дополнительная информация : Правильный ответ — A. Распространенным признаком дифтерии является наличие толстого слоя, образующегося в задней части глотки.По этой причине болезнь получила название «дифтерия», производное от греческого слова, означающего «кожаная кожа».

26. Какое заболевание, которое можно предотвратить с помощью вакцин, часто называют «спазмом челюсти»?

1. Ротавирус
2. Оспа
3. Столбняк
4. Корь

Дополнительная информация: Правильный ответ — C. Столбняк обычно называют «замкнутой челюстью», потому что инфекция обычно вызывает сильные и болезненные мышечные спазмы, включая мышцы головы и шеи.

27. Сколько типов ВПЧ было идентифицировано?

1. Около 50
2. Более 100
3. Около 75
4. Менее 10

Дополнительная информация: Правильный ответ — Б. Выявлено более 100 типов ВПЧ. Было обнаружено, что некоторые из них вызывают болезнь. Типы 16 и 18 являются наиболее частыми причинами рака шейки матки, а типы 6 и 11 — наиболее частыми причинами анальных и генитальных бородавок.

28.Какой вирус тесно связан с вирусом, вызывающим чуму у собак?

1. Ротавирус
2. Вирус краснухи
3. Вирус паротита
4. Вирус кори

Дополнительная информация: Правильный ответ — D. Вирус кори тесно связан с вирусом, вызывающим чуму у собак. В прошлом собак вакцинировали противокоревой вакциной, чтобы предотвратить появление чумы.

29. Какой вирус вызывает опухание желез головы и шеи, из-за чего инфицированные люди часто выглядят как бурундуки?

1. Вирус кори
2. Вирус паротита
3. Вирус гриппа
4. Вирус краснухи

Дополнительная информация: Правильный ответ — Б.Вирус паротита поражает слюнные железы примерно у 35 из 100 человек, инфицированных этим вирусом. Когда эти железы начинают набухать, зараженный человек часто выглядит как бурундук.

30. Какой вирус может молча жить в нервах в течение многих лет после первоначального заражения, а затем пробуждения из-за возраста или ослабленной иммунной системы?

1. Вирус паротита
2. Вирус краснухи
3. Вирус ветряной оспы
4. Вирус кори

Дополнительная информация: Правильный ответ — C.После заражения ветряной оспой вирус ветряной оспы незаметно живет в нервах. С возрастом их иммунная система ослабевает, что иногда приводит к пробуждению вируса опоясывающего лишая, вызывая опоясывающий лишай.

31. Какое заболевание, которое можно предотвратить с помощью вакцин, может возникнуть при попадании на рану или порез почвы, содержащей бактерии?

1. коклюш
2. Столбняк
3. Менингококковая инфекция
4. Пневмококковая инфекция

Дополнительная информация: Правильный ответ — Б.Столбняк обычно возникает при попадании на рану или порез почвы, содержащей Clostridium tetani . Поскольку заражение происходит через бактерии, занесенные в почву, от этой болезни нельзя защитить людей, живя в хорошо вакцинированном сообществе.

32. Какое заболевание, которое можно предотвратить с помощью вакцин, передается через пищу или воду, загрязненные фекалиями инфицированного человека?

1. Краснуха
2. Полиомиелит
3. Менингококковая инфекция
4. Пневмококковая инфекция

Дополнительная информация: Правильный ответ — Б. Вирус полиомиелита обнаруживается в кишечнике и обычно распространяется через пищу или воду, загрязненные фекалиями инфицированного человека. Иногда вирус полиомиелита распространяется через слюну.

33. Какое заболевание, которое можно предотвратить с помощью вакцин, не может передаваться от одного человека к другому?

1. ВПЧ
2. Столбняк
3. Ветряная оспа
4. Корь

Дополнительная информация: Правильный ответ: Б. Столбняк — единственное заболевание, которое можно предотвратить с помощью вакцин, которое не передается от человека к человеку.Люди, инфицированные столбняком, обычно подвергаются воздействию, когда рана соприкасается с зараженной почвой. По этой причине коллективный иммунитет, обеспечиваемый высокими показателями вакцинации, не распространяется на это заболевание.

34. Какая болезнь, которую можно предотвратить с помощью вакцин, может быть особенно смертельной для пожилых людей?

1. Пневмококковая инфекция
2. Битумная черепица
3. Корь
4. Ротавирус

Дополнительная информация: Правильный ответ — А.Пневмококковая инфекция известна как оппортунистическая инфекция, потому что она обычно атакует, когда иммунная система человека уже ослаблена другой инфекцией. Пневмококк особенно опасен для пожилых людей, когда вызывает пневмонию во время выздоровления от гриппозной инфекции.

35. Какие болезни, которые можно предотвратить с помощью вакцин, передаются через крошечные капельки, висящие в воздухе?

1. Гепатит В и ВПЧ
2. Ветряная оспа и опоясывающий лишай
3. Корь и ветряная оспа
4. Оспа и коклюш

Дополнительная информация: Правильный ответ — C.Вирусы кори и ветряной оспы передаются воздушно-капельным путем, висящим в воздухе. Инфекции, вызванные любым из этих вирусов, обычно более серьезны у взрослых, чем у детей.

36. Какое заболевание, предупреждаемое с помощью вакцин, не отличалось от оспы до конца XIX века?

1. Столбняк
2. Краснуха
3. Ветряная оспа
4. коклюш

Дополнительная информация: Правильный ответ — C. Поскольку ветряная оспа и оспа вызывали болезни, похожие на сыпь, эти две болезни не считались разными до конца 19 века.

37. Заражение каким вирусом может вызвать цирроз и заболевание печени?

1. ВПЧ
2. Вирус гепатита В
3. Вирус кори
4. Вирус паротита

Дополнительная информация: Правильный ответ — B. Люди с хроническим гепатитом B обычно страдают тяжелым поражением печени, известным как цирроз, который часто приводит к заболеванию печени или раку печени. Поскольку у большинства людей не проявляются симптомы хронической инфекции, они не знают, что инфицированы, до тех пор, пока у них не будет диагностирован рак печени.

38. Какую болезнь, которую можно предотвратить с помощью вакцин, раньше называли «ангелом-удушающим для детей»?

1. Дифтерия
2. Оспа
3. коклюш
4. Ветряная оспа

Дополнительная информация: Правильный ответ: A. Дифтерию называли «душащим ангелом детей» из-за толстой мембраны, которая образуется в задней части глотки, часто покрывая дыхательные пути и вызывая удушье.

39.У какого заболевания, которое можно предотвратить с помощью вакцин, имеется симптом, известный как «бычье горлышко»?

1. Свинка
2. Краснуха
3. Оспа
4. Дифтерия

Дополнительная информация: Правильный ответ — D. Распространенным симптомом дифтерии является «бычье горлышко», состояние, при котором железы на шее опухают, что часто делает инфицированного человека похожим на бычью шею.

40. Идитарод изначально был организован для доставки антисыворотки от какой болезни, которую можно предотвратить с помощью вакцин?

1. Дифтерия
2. коклюш
3. Ветряная оспа
4. Столбняк

Дополнительная информация: Правильный ответ — А. Alaskan Iditarod был первоначально организован в 1925 году для доставки антисыворотки против дифтерии в Ном, Аляска. Двадцать погонщиков и 150 ездовых собак преодолели около 674 миль по Аляске, пытаясь остановить вспышку дифтерии, которая происходила в городе и его окрестностях.

41. Низкий уровень иммунизации в США в конце 1980-х — начале 1990-х годов привел к вспышке какой болезни, которую можно предотвратить с помощью вакцин?

1. Haemophilus influenzae тип B (Hib)
2. Полиомиелит
3. Корь
4. Свинка

Дополнительная информация: Правильный ответ — C.Низкий уровень иммунизации в США привел к вспышке кори в конце 1980-х — начале 1990-х годов. Только в Калифорнии заразились 16 400 человек, почти 4 000 были госпитализированы и 75 умерли.

42. Какие болезни, предупреждаемые с помощью вакцин, могут вызывать менингит?

1. Пневмококковая инфекция, менингококковая инфекция и Haemophilus influenzae тип B
2. Ветряная оспа, опоясывающий лишай и дифтерия
3. ВПЧ и гепатит В
4. Гепатит А, столбняк и коклюш

Дополнительная информация: Правильный ответ — А.Менингит, или опухоль слизистой оболочки головного и спинного мозга, является возможным осложнением инфекции Haemophilus influenzae типа B, менингококка и пневмококка. Симптомы менингита могут включать ригидность шеи, лихорадку, рвоту, головную боль, судороги и кому.

43. К каким заболеваниям более подвержены люди без селезенки?

1. Пневмококковые и менингококковые заболевания
2. Ветряная оспа и корь
3. Дифтерия и коклюш
4. Полиомиелит и ротавирус

Дополнительная информация: Правильный ответ — А.Люди без селезенки более восприимчивы к пневмококку и менингококку. По этой причине им рекомендуется сделать вакцины для предотвращения этих заболеваний.

44. Какое заболевание, которое можно предотвратить с помощью вакцин, нельзя успешно лечить с помощью антибиотиков, потому что это вирус?

1. Грипп
2. Коклюш (коклюш)
3. Haemophilus influenzae тип B
4. Столбняк

Дополнительная информация: Правильный ответ — А.Поскольку грипп вызывается вирусом, его нельзя лечить антибиотиками. Однако противовирусные препараты могут подействовать.

45. Исследование, опубликованное в 1989 году, показало, какая концентрация вирусных частиц в морской воде?

1. 25 вирусных частиц на миллилитр
2. 2500 вирусных частиц на миллилитр
3. 250 000 вирусных частиц на миллилитр
4. 250 миллионов вирусных частиц на миллилитр

Дополнительная информация: Правильный ответ — D.Исследование, опубликованное в 1989 году, в котором изучалось присутствие вирусов в морской воде, обнаружило около 250 миллионов вирусных частиц в каждом миллилитре морской воды.

46. Какую роль вирусы играют в окружающей среде?

1. Чтобы способствовать разнообразию, убедившись, что ни один тип бактерий не становится доминирующим
2. Для создания коралловых рифов в тропиках
3. Для удаления водорослей с поверхности воды
4. Для создания оптимальных условий для роста и выживания растений

Дополнительная информация: Правильный ответ — А.Вирусы играют в окружающей среде множество ролей, в том числе способствуют сохранению биоразнообразия, так что один тип бактерий не становится доминирующим.

47. Генетическая мутация помогла защитить людей с серповидно-клеточной анемией от какого инфекционного заболевания?

1. Желтая лихорадка
2. Малярия
3. Дифтерия
4. Столбняк

Дополнительная информация: Правильный ответ — B. Мутация гена, вызывающая серповидно-клеточную анемию, является примером адаптации или изменения самого себя с целью адаптации к изменяющейся окружающей среде. Серповидно-клеточная анемия вызывает появление серповидных эритроцитов, которые защищают людей от малярии, поскольку вирус, вызывающий малярию, не может проникать в эритроциты такой формы.

48. Какой вирус может встречаться как у человека, так и у шимпанзе?

1. Полиомиелит
2. Гепатит В
3. HPV
4. Краснуха

Дополнительная информация: Правильный ответ — A. Помимо человека вирус полиомиелита может инфицировать шимпанзе. По этой причине ученые проверили эффективность потенциальных вакцин против полиомиелита на шимпанзе до их использования на людях.

49. Какое заболевание, которое можно предотвратить с помощью вакцин, убивает почти всех, кого заражает?

1. Полиомиелит
2. Краснуха
3. Ветряная оспа
4. Бешенство

Дополнительная информация: Правильный ответ — D. Бешенство обычно передается человеку через укус инфицированного животного. Вирус бешенства поражает мозг, вызывая энцефалит и, в конечном итоге, смерть в течение нескольких дней после появления симптомов.

50. Какая болезнь, которую можно предотвратить с помощью вакцин, убила почти 90 процентов цивилизаций ацтеков, инков и майя?

1. Краснуха
2. Полиомиелит
3. Оспа
4. Дифтерия

Дополнительная информация: Правильный ответ — C.Воздействие оспы на коренное население Америки является наглядной иллюстрацией того, как судоходство и европейская колонизация Америки также вызвали передачу ранее неизвестных болезней, предупреждаемых с помощью вакцин, уязвимым группам населения.

51. Какой процент населения мира имеет иммунодефицит?

1. 1 из 100
2. 10 из 100
3. 50 из 100
4. 75 из 100

Дополнительная информация: Правильный ответ — А.Иммунодефицит определяется как неспособность генерировать нормальный иммунный ответ. Фактически, 1 человек из 100 имеет иммунодефицит и, следовательно, может быть не в состоянии получить определенные вакцины. По этой причине высокий уровень вакцинации важен для защиты этой группы.

52. Какая компания разработала систему для отслеживания подозрений на грипп?

1. Google
2. Facebook
3. Яблоко
4. Microsoft

Дополнительная информация: Правильный ответ — А.Google создал Google Flu Trends, чтобы узнать об интересе населения к гриппу на основе интернет-поиска.

53. Какое ежегодное спортивное мероприятие было отменено в результате пандемии гриппа 1919 года?

1. Мировая серия
2. Кубок Стэнли
3. Финал НБА
4. Уимблдон

Дополнительная информация: Правильный ответ — B. Финальная игра в финале Кубка Стэнли 1919 года была отменена после того, как тренер и несколько игроков «Монреаль Канадиенс» были госпитализированы с гриппом.После того, как «Канадиенс» и «Сиэтл Метрополитанс» выиграли две игры и сыграли вничью в пятой игре, в шестой игре должен был быть определен победитель соревнования. Поскольку тренер «Канадиенс» не смог вывести на лед всю команду в последней игре, он проиграл; Однако наставник «Метрополитанов» отказался принять неустойку. В результате в финале Кубка Стэнли 1919 года победитель не был объявлен.

54. В Африке многие семьи не называют имен своих детей до тех пор, пока не минует угроза какого-либо заболевания, которое можно предотвратить с помощью вакцин?

1. Краснуха
2. Корь
3. коклюш
4. Полиомиелит

Дополнительная информация: Правильный ответ — Б.Многие семьи не называют имен своих детей до тех пор, пока не минует угроза кори. Эта распространенная в Африке практика вдохновила Софи Блэколл, талантливого иллюстратора, на создание плакатов для Инициативы по борьбе с корью и краснухой, в которых задокументирована текущая инициатива по искоренению кори.

55. В 1960-х годах зеркала убирали из комнат пациенток, страдающих каким заболеванием, которое можно предотвратить с помощью вакцин?

1. Оспа
2. Корь
3. Ветряная оспа
4. Полиомиелит

Дополнительная информация: Правильный ответ — А.Из-за обезображивания, вызванного оспой, из комнат больных женщин убирали зеркала, чтобы они не видели себя. Некоторые выжившие покончили жизнь самоубийством, вместо того чтобы жить с их изуродованной внешностью.

56. Сыпь, вызванная какими двумя болезнями, которые можно предотвратить с помощью вакцин, обычно путали в довакцинную эру?

1. Корь и ветряная оспа
2. Краснуха и оспа
3. Оспа и ветряная оспа
4. Краснуха и корь

Дополнительная информация: Правильный ответ — C.Сыпь, вызванную оспой, чаще всего путали с ветряной оспой, но иногда ее также путали с сыпью при кори и сифилисе.

57. Какой УИ может быть настолько уродливым, что выживших не узнать?

1. Свинка
2. Корь
3. Оспа
4. Краснуха

Дополнительная информация: Правильный ответ — C. Оспа была настолько обезображивающей, что в конце 1800-х годов сестра Исла Стюарт описала ее следующим анекдотом: две сестры в лагере сидели за одним столом в течение недели, не узнавая друг друга. Другие.

58. Какое заболевание, которое можно предотвратить с помощью вакцин, уничтожило племена коренных американцев, когда оно было занесено в Новый Свет?

1. Полиомиелит
2. Оспа
3. Гепатит А
4. коклюш

Дополнительная информация: Правильный ответ: Б. Ацтеки и инки в Южной Америке, а также алгонкины и наррангассеты в Северной Америке были практически уничтожены оспой, занесенной поселенцами. В некоторых случаях десять болезней распространялись намеренно, предлагая туземцам одеяла и портовые суда, зараженные гноем оспы.

59. Леди Мэри Монтегю, чей муж был послом Англии в Турции в 1700-х годах, написала домой, описывая вечеринки, которые намеренно рассказывают о какой болезни, которую можно предотвратить с помощью вакцин?

1. Полиомиелит
2. Гепатит А
3. Оспа
4. HPV

Дополнительная информация: Правильный ответ: C. Пожилые женщины в общинах в Турции устраивают «вечеринки» для 15 или 16 человек, желающих получить прививку в руку гноем от человека, заболевшего оспой в легкой форме.Они назвали эту процедуру прививкой.

60. Какая болезнь, которую можно предотвратить с помощью вакцин, вызвала глобальную пандемию в 1918 году?

1. Грипп
2. Полиомиелит
3. Оспа
4. Корь

Дополнительная информация: Правильный ответ: A. Глобальная пандемия гриппа 1918 года унесла жизни 25 миллионов человек, что примерно в три раза больше, чем все жертвы Первой мировой войны, закончившейся в том же году.

61.В настоящее время, сколько железных легких, по оценкам, будет эксплуатироваться в любой день в США?

1. 150
2. 100
3. 45
4. 30

Дополнительная информация: Правильный ответ — D. Железные легкие в настоящее время используются, чтобы помочь отучить пациентов, не страдающих полиомиелитом, от современных аппаратов ИВЛ.

62. Как звали корову, известную своей ролью в экспериментах Эдварда Дженнера по вакцинации против оспы?

1. Маргаритка
2. Бетти
3. Бесси
4. Цветение

Дополнительная информация: Правильный ответ — D.Блоссом был заражен коровьей оспой, которую Дженнер использовал для разработки противооспенной вакцины.

63. Жертвы какой болезни, которую можно предотвратить с помощью вакцин, хоронили в замазанных гробах, заполненных опилками, пропитанными формалином, еще в 1960-х годах?

1. Полиомиелит
2. Оспа
3. Менингит
4. Свинка

Дополнительная информация: Правильный ответ: Б. Формалин — это силовое денатурирующее соединение, используемое для разрушения химической структуры белков во всем, от тканей человека до капсул вирусов.

Документ без названия

Ранние современные болезни и методы лечения
Операции, уродства и болезни

Оспа и корь
Эмили Даймок

Оспа и корь были очень заразными болезнями, опустошавшими Европу с древних времен до наших дней, убив больше людей, чем все мировые войны вместе взятые.

В 1967 году Всемирная организация здравоохранения поставила перед собой цель искоренить оспу, а в 1980 году она была официально сертифицирована как искорененная. Впервые оспа была зарегистрирована в Европе где-то между 160-180 годами нашей эры, вероятно, привезенная с востока римскими легионами, и была известна как чума. Антония, названного в честь правящего римского императора Марка Арелиуса Антония. (1) Несколько популяций, таких коренных племен по всей Америке, которые никогда не сталкивались с оспой до того, как она была принесена к их берегам европейцами в течение шестнадцатого и семнадцатого веков, и они были истреблены как у них не было естественного сопротивления или иммунитета, которые передавались при контакте с болезнью.В начале семнадцатого века врач Исбранд де Димербрук заметил, что люди, пережившие приступ оспы, не будут восприимчивы к ней, даже если они переживут болезнь во второй раз. Он пришел к выводу, что полный иммунитет — это результат выживания после болезни; однако в случае эпидемии оспы все граждане, которые ранее подвергались воздействию вируса, имели естественную сопротивляемость болезни в результате их предыдущего контакта. (2) Таким образом, наиболее восприимчивыми к болезни членами населения были дети. которые еще не пережили вспышку оспы, и от нее погиб каждый третий ребенок, инфицированный

В 1655 году четыре врача королевы Елизаветы выразили общее мнение, что предрасположенность детей ко многим заболеваниям, особенно оспе и кори, передается через менструальную кровь беременных женщин.Если мать подвергалась воздействию неестественно высокой температуры тела из-за лихорадки, погодных условий или чрезмерного физического труда, кровь матери испортилась. Эта испорченная кровь смешалась с кровью будущего ребенка в утробе матери, что сделало ребенка уязвимым для оспы и кори.

Во всем теле усиливается неестественный жар, вызывающий кипение крови, в результате чего эта грязная менструальная субстанция отделяется от нашей естественной крови, и природа, оскорбленная и захваченная ею, выталкивает ее к наружным порам кожи, как будто экскременты крови, которые имеют значение, если они горячие и слизистые, вызывают оспу, а если они сухие и жидкие, то вызывают корь.(3)

Исбранд Димерброк, врач-преподаватель из Утрехтского университета, одного из старейших университетов Республики семи объединенных провинций (ныне Нидерланды), и автор расширенного медицинского трактата по оспе и кори, согласился с тем, что уязвимость ребенка к заболевание сформировалось в матке. Его теории объясняли, почему, по его мнению, мужчины с большей вероятностью заразились этим заболеванием, потому что женщины ежемесячно сливали испорченную материнскую кровь, в то время как она продолжала гноиться только внутри мужчины.(4) Раннее современное представление о менструальной крови было как положительным, так и отрицательным, когда оно касалось предрасположенности ребенка к заражению оспой и корью. Утверждалось, что менструальная кровь дает женщинам преимущество с точки зрения здоровья и дает им более сильную сопротивляемость болезням, поскольку они могут очистить себя от пороков, обнаруженных в их крови. Однако, поскольку эти пороки сформировались в матке, было доказано, что дети, особенно мальчики, имеют гораздо более высокий риск заражения этими смертельными заболеваниями.

Ранние современные врачи рассматривали другие внешние причины, которые могли привести либо к оспе, либо к кори. Ранний современный врач и аптекарь Николас Калпепер утверждал, что наиболее важной внешней причиной была нечистота, присутствующая в воздухе, которая могла усугубить или воспламенить уже существующее разложение в крови.(5) Вторая внешняя причина была связана с балансом крови и жидкости в теле больного человека, на который влияло недостаточное количество упражнений, слишком частое купание, чрезмерный гнев или страх или переедание. Третьим, согласно Димербруку, была инфекция, которая, как он утверждал, постоянно вытекала из тел больных и могла отравить любого, кто с ней контактировал. (6) Все медицинские трактаты рекомендовали всем, не только детям, кто никогда не болел оспой, следует избегать контактов с больными или теми, кто их лечил.

Как отмечали многие современные врачи, первым симптомом оспы и кори была лихорадка. По словам Джона Печи (из Коллегии врачей в Лондоне, 1697), лихорадка, сопровождавшая корь, могла быть настолько легкой, что могла остаться незамеченной. Хотя оспа также началась с лихорадки, она обычно была гораздо более горячей и сопровождалась судорогами, сильной болью в спине, насморком, учащенным пульсом и затрудненным дыханием. (7) Пятна сначала появлялись на лице, а затем распространялись на руки, ноги и грудь.Пустулы также могут появляться на внутренней стороне горла, ушей, носа, под веками и на внутренних органах, что может вызвать внутреннее кровотечение. Рубцы на горле тоже могли задушить жертву, поэтому болезнь была намного опаснее кори. Ранние современные авторы описали рубцы от оспы, которые поднимались, образуя белые покрытые крышкой ямы на коже, которые были заполнены разлагающимися жидкостями, которые тело пыталось рассеять. Практикующие врачи утверждали, что чем быстрее сформируются эти белые колпачки и спадет лихорадка, тем лучше будет прогноз для страдающего человека.Если рубцы не образовались быстро или они снова погрузились в плоть после всплытия, современные врачи пришли к выводу, что гнилостные выделения воспламеняли внутренние части тела, что приводило к продолжительной лихорадке и возможной смерти или же к жизни в течение долгого времени. инвалидность. Однако ранние современные медицинские изображения не передают ужаса и серьезности болезни. Каждое изображение изолировало оспу на изображения крупным планом, показывающие только одну или две пустулы, что отделяет физические последствия болезни от страданий ребенка.Единственный способ понять серьезность болезни — это сравнить изображения, сделанные в раннем Новом времени, с фотографиями начала двадцатого века, которые показывают все эффекты болезни. Это обеспечивает всестороннее понимание физического характера заболевания, сочетая подробный вид отдельных пустул с изображением, которое показывает симптомы по всему телу ребенка.

Амбруаз Пар, известный французский врач и хирург шестнадцатого века, утверждал, что оспу и корь нельзя отличить друг от друга до третьего или четвертого дня после того, как пятна начали появляться на коже. Когда ребенок болел оспой, пятна заполнялись гнилостной жидкостью кремового цвета к третьему или четвертому дню, образуя белые покрытые оспой следы, которые в конечном итоге покрывались коркой и отпадали.Однако пятна, образовавшиеся от кори, оставались плоскими и красными на протяжении всей болезни. Пар утверждает, что

«Оспа возникает из более грубого и вязкого вещества, а именно из флегматического юмора. Но корь более тонкого и горячего, то есть холерического вещества, поэтому это не дает никаких следов, но дает определенные маленькие пятна без любая опухоль, и эти красные, пурпурные или черные. Но при оспе выделяются пустулы, белые в середине, но красные в окружности, аргумент крови смешанный при холере.(8)

Французский хирург также различал эти две болезни на основании тяжести разлагающего вещества, вызвавшего каждую болезнь. Он утверждал, что при сравнении характер кори был тонким и менее резким, чем характер, вызвавший оспу. Ключевое различие Парса между корью и оспой заключалось в том, что порча, вызвавшая корь, не оставалась в ловушке под кожей больного, и именно поэтому он объяснил, что пятна, вызванные корью, не были такими зудящими или болезненными, как пятна, образованные корью. оспа.(9)

В своих трактатах медицинские авторы обычно описывали различные методы лечения после подробного описания различных симптомов, которые могли указывать на присутствие либо оспы, либо кори. Во время лихорадки врачи королевы Елизаветы и Амвросий Пар рекомендовали, что лучшим лечением было держать больных отдельно от остальных членов семьи, накрывать их теплыми, предпочтительно красными одеялами и позволять им пропотеть от лихорадки. Красный цвет считался одновременно лечебным и вредным из-за его способности вызывать дальнейшее воспаление у больных.Амброуз Парей утверждал, что людям, заболевшим оспой под веками, не следует смотреть на цвет, поскольку он утверждал, что это усилит жар и опухоль под веками, что может быстро привести к слепоте (10). утверждалось, что оно также имеет терапевтический эффект, поскольку красные одеяла были зарегистрированы как провоцирующие появление оспы посредством симпатической реакции: красную оспу привлекало красное одеяло, которое помогало вывести испорченные жидкости на поверхность кожи, чтобы ускорить прогрессирование и выздоровление от болезни.Многие практикующие наблюдали и записывали красные одеяла, чтобы спровоцировать болезнь намного быстрее, чем одеяла любого другого цвета. Однако в Европе раннего Нового времени одеяла окрашивались в определенные цвета, что указывало на их толщину, а красный цвет указывал на самую толстую ткань одеяла, что делало их наиболее эффективными при согревании пациентов с лихорадкой (11).

Майкл Андервуд рекомендовал использовать флеботомию (или кровотечение) как еще один способ облегчить жар при лихорадке как до, так и после того, как температура спала, при условии, что ребенок был достаточно взрослым, чтобы перенести процедуру (обычно после того, как ребенок прошел процедуру). первый набор зубов). (12) Однако Андервуд, Печи и Димербрук призвали к осторожности при лечении детей, принимая во внимание их возраст, состояние здоровья и темперамент.Считалось, что кровотечение излечивает диарею (рыхлость кишечника), которая была одним из самых смертоносных побочных эффектов, сопровождавших как оспу, так и корь. Кровотечение вылечило эту рыхлость, потому что в соответствии с ранней современной гуморальной медициной оно предотвращало прилив воспаленной и испорченной крови к кишечнику больного, что могло быть смертельным. (13) Врачи королевы Елизаветы рекомендовали кровотечение из руки, если оспа еще не затронула кожу, но только если больной был старше четырнадцати лет.Если бы они были моложе, то лечение могло бы принести больше вреда, чем пользы, поскольку маленькие дети уже считались слишком слабыми, чтобы выдержать кровотечение, и после дальнейшего разложения, вызванного болезнью, они почти наверняка умрут. Королевские врачи королевы Елизаветы посоветовали лучший способ слить кровь из младших детей с помощью кровососов (то есть пиявок), а не перерезать одну или несколько вен (14).

Гравюра из книги Роберта Уиллана «О кожных заболеваниях» (Лондон, J.Джонсон, 1808 г.) Предоставлено Библиотекой редких книг Томаса Фишера, Университет Торонто После того, как лихорадка утихла и единственными оставшимися следами болезни были рубцы на коже, многие богатые люди просили использовать золотую иглу, которая использовалась для разрушения и осушения пустул в попытке ускорить процесс заживления. обработать и уменьшить рубцы. Амброуз Пар рекомендовал это лечение как способ высвободить гнилостную жидкость, застрявшую в пустулах, которые, как он утверждал, разъедали здоровую кожу под ними, в конечном итоге вызывая серьезные рубцы, связанные с оспой.(15) Врачи королевы Елизаветы объяснили лечение:

Золотой булавкой или иглой, или из-за ее отсутствия медной булавкой с подачей, вы открываете каждую пустулу наверху и таким образом выталкиваете в нее вещество очень мягко и осторожно мягкой льняной тканью, и, если вы почувствуете, места снова заполнятся, затем откройте их снова, как вы это сделали вначале, потому что, если вы действительно допустите, чтобы материя, которая в них, оставалась надолго, тогда она будет раздражать и разъедать плоть, которая является причиной тех ям, которые остаются после того, как оспа исчезнет.(16)

Дать болезни идти своим чередом было единственным известным лекарством от любой из этих болезней, поскольку все методы лечения, рекомендованные врачами раннего нового времени, были предназначены для облегчения симптомов и ускорения развития болезни. Димерброк подробно рассказал о многих лекарствах, предназначенных для укрепления внутренних органов, помощи при дыхании страдающих детей и для ускорения прогрессирования лихорадки, но пришел к выводу, что время было единственным истинным лекарством. Димербрук признал, что многие родители (особенно богатые) не хотели нанимать врача, который мало что сделал бы для их больного ребенка.Поэтому практичный Димерброк включил в свою книгу средство, которое облегчило бы беспокойство родителей, не сказав при этом на здоровье ребенка:

Назначьте небольшое количество безоарового камня с магическим жемчугом, или крабовыми глазами, или эссенцией загона, добавив к ним несколько крупинок шафрана или какой-нибудь сосущий предмет, который не будет мешать природе в ее работе. (18)

Наиболее эффективным шагом в профилактике оспы было изобретение вакцины англичанином Эдвардом Дженнером в конце восемнадцатого века, и это была первая широко используемая вакцина в истории медицины.В 1798 году Эдвард Дженнер опубликовал отчет о первой успешной вакцинации в Европе, которая оказалась очень эффективной в профилактике даже самых тяжелых случаев оспы у тех, кто проходил лечение. Его техника заключалась в введении небольшого количества коровьей оспы — штамма натуральной оспы, встречающегося только у коров, — которая вызывала небольшие гнойнички на коже человека, которые контактировали с инфекцией. Разница между коровьей оспой и оспой проиллюстрирована на соседнем изображении, где оспа (справа) образует намного больше пустул и не образует струп до гораздо более позднего развития.Испытание Дженнерса включало инъекцию материала коровьей оспы, взятого из руки молодой слабой горничной, Сары Нельмес, у которой были пустулы коровьей оспы в результате контакта с инфицированной коровой, и инъекции его испытуемому Джеймсу Фиппсу, восьмилетнему сыну садовника Дженнерса, как показано на рисунке справа. Шесть недель спустя Фиппс намеренно заразился натуральной оспой, и у него не было никаких симптомов болезни. Дженнер утверждал, что вакцина обеспечивает защиту на всю жизнь, но она была подвергнута резкой критике со стороны общественности, поскольку в конечном итоге было доказано, что вакцина Дженнерса обеспечивает защиту только на срок до десяти лет.В 1840 году в Великобритании был принят Закон о вакцинации, предусматривающий бесплатные прививки для всех детей в попытке контролировать продолжающуюся эпидемию оспы. Этот акт также сделал незаконными прививки, которые имели больше возможностей для распространения болезни, чем для ее предотвращения.

В 1967 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) поставила цель искоренить оспу. Оспа была главным кандидатом на искоренение, потому что она передавалась исключительно при контакте с людьми, имела короткий инкубационный период и не имела естественного животного-хозяина; предполагалось, что можно полностью искоренить болезнь.С помощью целевых групп реагирования, сформированных ВОЗ, целью которых было наблюдение за любыми вспышками, которым было поручено установить зоны строгого карантина и обязательную вакцинацию в городах и прилегающих районах, где было зарегистрировано заболевание. Последний естественный случай более тяжелого штамма натуральной оспы, большой оспы, был зарегистрирован в Бангладеш у двухлетнего Рахима Бану в 1975 году (изображение слева), а последний случай малой оспы, который произошел в 1977 году, был обнаружен в Сомалийском Али. Маоу Маалин.К 1980 году оспа была классифицирована ВОЗ как официально искорененная, что ознаменовало собой одну из самых больших побед над болезнью, которую когда-либо осознавало человечество (22).

Заметки:

1) Дональд Р. Хопкинс. Князья и крестьяне: оспа в истории. (Издательство Чикагского университета: Чикаго, 1983) стр. 22.

2) Исбранд де Димерброк. Пер. Уильям Сэлмон. Анатомия человеческого тела; Понимание самых современных открытий и раритетов в этом искусстве, к которому добавлен Особый трактат о оспе и кори вместе с несколькими практическими наблюдениями и опытными методами лечения.(Лондон, напечатано для У. Уитвуда, 1694 г.) стр. 2.

3) М.А. Шкаф королевы Елизаветы с физическими секретами. (Лондон: Уилл Ширес, 1656 г.) стр. 51-52.

4) Исбранд де Димерброк. Пер. Уильям Сэлмон. Анатомия человеческого тела; Понимание самых современных открытий и раритетов в этом искусстве, к которому добавлен Особый трактат о оспе и кори вместе с несколькими практическими наблюдениями и опытными методами лечения. (Лондон, напечатано для У. Уитвуда, 1694 г.) стр. 5.

5) Николас Калпепер.Справочник Кулпеперс для акушерок или Справочник для женщин. (Лодон: Напечатано Питером и Эдвардом Коулами, 1662 г.) p234.

6) Исбранд де Димербрук. Пер. Уильям Сэлмон. Анатомия человеческого тела; Понимание самых современных открытий и раритетов в этом искусстве, к которому добавлен Особый трактат о оспе и кори вместе с несколькими практическими наблюдениями и опытными методами лечения. (Лондон, отпечатано для У. Уитвуда, 1694 г.) стр. 6

7) Джон Печи. Общий трактат болезней младенцев и детей.(Лондон: напечатано для Р. Веллингтона, 1697 г.) стр. 27.

8) Амбруаз Парей, пер. Чт. Джонсон. Произведения знаменитого хирурга Амвросия Парея. (Лондон, Th. Cotes и R.Young Anns, 1634), стр. 757-758.

9) Там же, 758.

10) Там же, 760.

11) Исбранд де Димербрук. Пер. Уильям Сэлмон. Анатомия человеческого тела; Понимание самых современных открытий и раритетов в этом искусстве, к которому добавлен Особый трактат о оспе и кори вместе с несколькими практическими наблюдениями и опытными методами лечения.(Лондон, напечатано для У. Уитвуда, 1694 г.) стр. 14-15.

12) Исбранд де Димерброк. Пер. Уильям Сэлмон. Анатомия человеческого тела; Понимание самых современных открытий и раритетов в этом искусстве, к которому добавлен Особый трактат о оспе и кори вместе с несколькими практическими наблюдениями и опытными методами лечения. (Лондон, напечатано для У. Уитвуда, 1694 г.) стр. 115.

13) Джон Печи. Общий трактат болезней младенцев и детей. (Лондон: отпечатано для Р.Веллингтон, 1697 г.) стр. 46.

. 14) M.A. Шкаф королевы Елизаветы с физическими секретами. (Лондон: Уилл Ширес, 1656) стр. 56.

. 15) Амбруаз Парей, пер. Чт. Джонсон. Произведения знаменитого хирурга Амвросия Парея. (Лондон, Th. Cotesand R.Young Anns, 1634) стр. 760.

16) М.А. Шкаф королевы Елизаветы с физическими секретами. (Лондон: Уилл Ширес, 1656 г.) стр. 59.

17) Джон Печи. Общий трактат болезней младенцев и детей. (Лондон: отпечатано для Р.Веллингтон, 1697 г.) стр. 37.

18) Исбранд де Димерброк. Пер. Уильям Сэлмон. Анатомия человеческого тела; Понимание самых современных открытий и раритетов в этом искусстве, к которому добавлен Особый трактат о оспе и кори вместе с несколькими практическими наблюдениями и опытными методами лечения. (Лондон, напечатано для У. Уитвуда, 1694 г.) стр. 14.

19) Дональд Р. Хопкинс. Князья и крестьяне: оспа в истории. (Издательство Чикагского университета: Чикаго, 1983) стр. 17.

20) Майкл Андервуд, Трактат о детских болезнях с указаниями по ведению младенцев с самого рождения. (Лондон: Дж. Мэтьюз, 1784) стр. 116-117.

21) Там же, 117.

22) Деррик Бэксби, Конец истории оспы сегодня. Март 1999 г., v 49, i3, p14.

Ученые отслеживают и идентифицируют происхождение штаммов противооспенной вакцины, использованных во время Гражданской войны — Яркий мир

Набор для вакцинации времен Гражданской войны в США, хранящийся в Музее Мюттера при Коллегии врачей Филадельфии.

Ученые и историки, работающие в Университете Макмастера, Музее Мюттера и Сиднейском университете, собрали вместе геномы старых вирусов, которые использовались в качестве вакцинных штаммов во время и после Гражданской войны в США, что в конечном итоге привело к искоренению оспы.

Оспа была одним из самых разрушительных вирусных заболеваний, когда-либо поражавших человечество, убивая примерно трех из каждых 10 инфицированных. Те, кто выжил, часто были инвалидами, слепыми или изуродованными.

Всемирная организация здравоохранения недавно отметила 40 годовщину искоренения оспы, что стало самой успешной кампанией из когда-либо предпринятых. Поскольку исследователи во всем мире лихорадочно работают над разработкой вакцины против COVID-19, успех кампании и результаты этой статьи, описанные в журнале Genome Biology, указывают на ценность вакцинации, говорят исследователи. Они предполагают, что другие вакцины ждут своего открытия среди вирусных родственников современного гриппа и коронавирусов.

«Понимание истории, эволюции и способов, которыми эти вирусы могут функционировать в качестве вакцин, чрезвычайно важно в наше время», — говорит эволюционный генетик Хендрик Пойнар, директор Центра древней ДНК Макмастера, где проводилась работа. , а также главный научный сотрудник университетского института инфекционных болезней Майкла Дж. ДеГрута.

«Эта работа указывает на важность изучения разнообразия этих вакцинных штаммов, обнаруженных в дикой природе.Мы не знаем, сколько из них может обеспечить перекрестную защиту от широкого спектра вирусов, таких как грипп или коронавирусы ».

Концепция широко распространенной вакцинации восходит к 1796 году, когда английский врач Эдвард Дженнер, известный своим выдающимся вкладом в медицину, заметил, что заражение более легкой болезнью (называемой коровьей оспой), как считалось, передается от коров с похожей на оспу болезнью. их вымя дояркам служило защитой от будущих вспышек оспы.

Однако метод и исходный материал, использованные для ранней вакцинации против оспы, оставались нестандартными на протяжении более века.Хотя «коровья оспа» часто упоминается как источник первой вакцинации, мало что было известно о конкретном происхождении и разнообразии штаммов вируса, используемых в программах ранней вакцинации против оспы

Для своего исследования исследователи использовали сложные методы, разработанные в Центре древней ДНК Макмастера, чтобы реконструировать и проанализировать геномы вирусных фрагментов, извлеченных из наборов для вакцинации, используемых в эпоху гражданской войны.

Наборы, входящие в медицинскую коллекцию Музея Мюттера при Колледже врачей Филадельфии, содержали ланцеты и небольшие стеклянные тарелки для смешивания жидкости для вакцин, собранных из волдырей намеренно инфицированных субъектов, а также жестяные коробки со сдвигающимися крышками. содержат паршу.

Методы, использованные в этой статье, привели к успешному извлечению вирусных молекул как из органических источников, таких как материал парши, так и из неразрушающего отбора образцов неорганических материалов, таких как жестяные коробки и стеклянные предметные стекла, которые не содержали никаких доказательств органические остатки.

Это открытие открывает новые возможности для изучения истории болезни посредством неразрушающего исследования материалов, ранее связанных с биологическими образцами.

Исследователи смогли определить, что в 1860-х и 1870-х годах практикующие врачи в Филадельфии использовали штамм вируса осповакцины , который все еще распространялся на людях.Более мягкий родственник смертельного возбудителя оспы вводился в организм, как правило, путем нанесения гноя или струпьев на царапину или порез на коже, что помогало реципиентам развить иммунитет к оспе.

Основное беспокойство по поводу дизайна вакцины заключается в том, насколько близок — с эволюционной точки зрения — штамм вакцины к штамму, вызывающему заболевание, чтобы предотвратить болезнь. Здесь штаммы осповакцины, используемые для вакцинации, на самом деле очень отдаленно связаны с вирусом, вызывающим оспу.Низкая скорость мутаций ортопоксвирусов (членами которых являются как оспа, так и оспа), вероятно, позволяет использовать эту «отдаленную» защиту.

«Вакцинация — это замечательный процесс с богатой историей болезни, который мы должны отметить», — говорит Ана Дагган, бывший постдок отдела антропологии в Макмастере, ныне работающая в Агентстве общественного здравоохранения Канады, которая была ведущим исследователем изучение. «Медицинские музеи — это невероятные хранилища нашего прошлого и нашей коллективной истории.Новые инструменты, которые мы разрабатываем в этой работе, позволяют нам начать исследовать, как медицинские источники, процедуры и методы менялись с течением времени ».

пробирок оспы заподозрили для того чтобы содержать живой вирус

Центры контроля за заболеванием в настоящее время испытывают пробирки вируса оспы десятилетней давности, которые были обнаружены на прошлой неделе в холодильнике хранения на здоровье национальных институтов в Мэриленде. Хотя в шести стеклянных флаконах было обнаружено ДНК оспы, представители здравоохранения до сих пор не знают наверняка, живы ли образцы и являются ли они потенциально опасными.

Доктор Стефан Монро, заместитель директора Национального центра новых и зоонозных инфекционных заболеваний при CDC, сказал CBS News: «Я не удивлюсь, если один или несколько из этих образцов будут содержать живой растущий вирус оспы».

В эксклюзивном интервью с главным медицинским корреспондентом CBS News доктором Джоном ЛаПуком Монро сказала, что флаконы теперь хранятся в лаборатории с высоким уровнем биобезопасности 4 в CDC для тестирования. «Это возможно, но мы не знаем наверняка, сможет ли вирус оспы в этих образцах по-прежнему расти в лаборатории, и это эксперименты, которые в настоящее время продолжаются», — сказал Монро.

Поразительное открытие флаконов с оспой исследователем из NIH потребовало многосторонней реакции со стороны NIH, CDC, FDA, Всемирной организации здравоохранения, а также ФБР и даже Совета национальной безопасности Белого дома.

Монро объяснил, что Белый дом был уведомлен, потому что «оспа является потенциальным агентом биотерроризма, поэтому каждый раз, когда возникает проблема, связанная с оспой, сотрудники национальной безопасности хотят быть в курсе».

Вирус оспы, также известный как натуральная оспа, был объявлен искорененным в 1980 году благодаря усилиям по вакцинации во всем мире.В настоящее время образцы вируса разрешены только в двух лабораториях строгого режима в мире: в Центре контроля заболеваний в Атланте, штат Джорджия, и в Государственном исследовательском центре вирусологии и биотехнологии в Новосибирске, Россия.

Актуальные новости

Актуальные новости Более

Монро сказал, что правительство США накопило запас вакцины против оспы, достаточно большой, чтобы охватить все население страны, на случай, если она когда-нибудь понадобится.

Он сказал, что подозревает, что по крайней мере некоторые из давно утерянных флаконов могут содержать живой вирус, потому что вакцина от оспы способна выжить в условиях, аналогичных тем, в которых образцы хранились более пяти десятилетий.

«Что мы действительно знаем, так это то, что вещи очень стабильны в лиофилизированном состоянии, и, например, вакцина, которая исторически использовалась для кампании по искоренению оспы, была лиофилизирована, а затем, как правило, хранилась в морозильной камере, а затем была восстановлена. прямо перед использованием «, — сказал он.Он добавил, что при правильном охлаждении некоторые запасы вакцин, как известно, сохраняют свою активность в течение 20 лет.

Лишь немногие избранные имеют доступ к лаборатории CDC с уровнем биобезопасности 4, где в настоящее время проходят испытания флаконы. Лаборатория защищена системой высокого уровня безопасности, которая включает камеры наблюдения и двери с сигнализацией. Чтобы проверить личность людей, которые входят, учреждение использует сканер радужной оболочки глаза, который считывает уникальный образец глаза и сопоставляет его с записями из существующей базы данных.

Монро сказал, что CDC и Всемирная организация здравоохранения согласились уничтожить существующие образцы оспы после того, как они будут протестированы, хотя сроки не были указаны. «Обнадеживает то, что мы знаем из предыдущего опыта, как бороться со вспышками оспы и как избавиться от нее в мире», — сказал он.

Что касается вопроса о том, как эти флаконы с оспой ускользали от внимания в течение стольких лет, Монро могла только сказать, что это «одна из тех случайностей». Он сказал, что это была коллекция, которую собрал исследователь, «но со временем…. коробки были забыты. «

» Безусловно, один из уроков, извлеченных из этого эпизода, заключается в том, что лаборатории по всему миру должны иметь твердое представление о том, что у них есть в своих коллекциях, и … должны приложить усилия, чтобы сделать полную инвентарь »

Сын вакцинированного солдата тяжело инфицирован коровьей оспой

19 марта 2007 г. (Новости CIDRAP) — 2-летний мальчик из Индианы находится в критическом состоянии в чикагской больнице с экземой Vacinatum, редким типом кожной инфекции, вызванной вирусом осповакцины, которым он заразился при контакте со своим отцом, солдатом, который недавно сделал прививку от оспы.

Мальчик, у которого в анамнезе была экзема, фактор риска серьезных инфекций, вызванных осповакциной, болеет с начала марта и проходит лечение в детской больнице Комер Чикагского университета. Он получил несколько лекарств, в том числе экспериментальный противовирусный препарат от оспы.

Согласно заявлению Медицинского центра Чикагского университета (UCMC) от 16 марта, отец мальчика получил вакцину против оспы, в которой вирус осповакцины является активным ингредиентом, в конце января в рамках подготовки к военной службе.Но его отправка была отложена, и в середине февраля ему разрешили навестить семью. Во время визита он имел тесный контакт со своим сыном.

В начале марта мальчик заболел сыпью и был госпитализирован в Восточном Чикаго, штат Индиана. Когда сыпь продолжила распространяться, 3 марта он был доставлен в UCMC, говорится в заявлении UCMC. Его мать также болеет коровьей оспой, хотя и в легкой форме, и госпитализирована вместе с сыном.

Инфекция была почти смертельной
К выходным, 10 и 11 марта, у мальчика появилась сыпь на 80% тела, и он был близок к смерти.Мадлен Кахана, заведующая отделением детской реанимации UCMC. По сообщению Chicago Tribune , начинался сепсис, и ему пришлось поставить искусственную вентиляцию легких.

Врачи лечили его иммуноглобулином осповакцины (VIG), основным рекомендованным препаратом для лечения экземы вакцинатум, который был выпущен Центрами по контролю и профилактике заболеваний (CDC) из Стратегического национального запаса. Он также лечился противовирусным цидофовиром и экспериментальным противооспенным препаратом под названием ST-246, сообщил UCMC.

По запросу CDC Управление по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) предоставило экстренное разрешение на испытание ST-246, согласно сообщению Chicago Sun-Times от 18 марта. В ходе экспериментов препарат защищал животных от вирусов коровьей оспы и других вирусов оспы, и, по словам его создателя, SIGA Technologies, Inc., он прошел клинические испытания фазы 1.

По словам педиатра UCMC, которого цитирует Sun-Times, состояние мальчика постепенно улучшилось с 11 марта, когда началось лечение ST-246.

Кахана сообщил сегодня CIDRAP News, что мальчик все еще находится в критическом состоянии и находится на искусственной вентиляции легких, поскольку инфекция затронула всю толщину эпидермиса примерно на 20% его тела. Но примерно за неделю у него не было новых повреждений, добавила она.

По словам Каханы, сначала его лечили VIG, через несколько дней — цидофовиром, а через несколько дней — ST-246. «Изначально я не знала, что CDC или фармацевтическая компания были очень рады разрешить нам использовать экспериментальный противовирусный препарат, но у нас не было особого выбора», — сказала она.

Она сказала, что ребенку вводят огромные дозы VIG: «Мы далеко вышли за рамки установленных ранее VIG … Мы пропустили пару дней [лечения], но немного».

Кахана сказал, что трудно сказать, какое из лекарств больше всего способствует улучшению состояния пациента.

Он также принимает обезболивающие и получает лечение раны, «очень похожее на лечение ожогового пациента», — сказала она.

Первоначально ему требовалась искусственная вентиляция легких из-за «острой гипоксической дыхательной недостаточности, связанной с сепсисом или системной воспалительной реакцией», но теперь его потребность в вентиляции связана с приемом обезболивающих.

В военной программе ранее не было случаев
Военные США возобновили свою давно прекращенную программу вакцинации против оспы в конце 2002 года, и к июню 2006 года около 1,1 миллиона военнослужащих, направлявшихся на Ближний Восток и в другие районы высокого риска, были вакцинированы.По данным веб-сайта Министерства обороны США, до сих пор в программе не сообщалось о случаях вакцинации или прогрессирующей осповакцины.

Экзема — это хорошо известное противопоказание для вакцинации против оспы, и в правилах безопасности говорится, что вакцинированные должны избегать контактов с кем-либо, у кого в анамнезе была экзема, до тех пор, пока поражение, вызванное вакциной, полностью не заживет. Но, согласно отчету Sun-Times , врачи сказали, что отец больного мальчика не знал, что ему следует держаться подальше от своего сына после вакцинации.

В отчете Tribune говорилось, что непонятно, почему солдату разрешили контактировать со своим сыном так скоро после иммунизации. Представитель армии сказал, что официальные лица изучают этот вопрос.

Данные в основном за 1960-е годы предполагают, что по данным CDC, вакцинация от экземы произошла от 10 до 39 случаев на каждый миллион впервые вакцинированных против оспы. Но широко распространенная сегодня иммунизация против оспы может привести к более высокому уровню из-за большого числа людей с иммунитетом, ослабленным лечением рака, другими иммуносупрессивными препаратами и ВИЧ.

В заявлении UCMC говорится, что персонал детской больницы Комер сразу же заподозрил серьезную и потенциально заразную вирусную инфекцию, когда прибыл больной ребенок. Следовательно, они приняли всесторонние меры предосторожности, чтобы предотвратить распространение коровьей оспы среди медицинских работников и других пациентов, в том числе поместили мальчика и его мать в комнату с отрицательным давлением.

В заявлении говорится, что специалисты по инфекционному контролю тщательно задокументировали все контакты персонала с мальчиком и его матерью.Центр контроля заболеваний связался с людьми, которые могли контактировать с мальчиком до его госпитализации в Чикаго, и никаких дополнительных случаев обнаружено не было.

См. Также:

Сайт CDC по оспе
http://www.bt.cdc.gov/agent/smallpox/index.asp

Journal of Virology отчет об исследовании ST-246 на животных
http://jvi.asm.org/cgi/content/abstract/79/20/13139

Пресс-релиз Siga Technologies об использовании ST-246 в данном случае
http: // www.siga.com/?ID=39

Пресс-релиз Siga о клиническом испытании ST-246
http://www.siga.com/?ID=52

Информация о вакцинации против оспы Министерства обороны США
http://www.smallpox.army.mil/event/SPSafetySum.asp

Обзор CIDRAP по натуральной оспе, включая информацию о рисках вакцинации

Агонисты TLR3 и TLR9 повышают эффективность вакцинации живыми противооспенными вакцинами после контакта

Реферат

Ликвидация оспы и прекращение кампании вакцинации привело к увеличению процента невакцинированных лиц, что подчеркивает необходимость эффективных контрмер после контакта в случае случайного или преднамеренного выброса вируса.Интраназальная инфекция мышей вирусом эктромелии (ECTV), моделью оспы человека, излечима путем вакцинации высокой дозой вакцины, вводимой в течение 3 дней после контакта. Для дальнейшего расширения этого защитного окна и снижения заболеваемости мышей после контакта вакцинировали вакциной Vaccinia-Lister, обычной противооспенной вакциной, или модифицированной вакциной против оспы Ankara, сильно аттенуированной вакциной в сочетании с агонистами TLR3 или TLR9. Мы показываем, что совместное введение агониста TLR3 поли (I: C) даже через 5 дней после контакта обеспечивает защиту, избегая необходимости увеличивать дозу вакцинации.Эффективные методы лечения предотвращали смерть, улучшали симптомы заболевания, снижали вирусную нагрузку и поддерживали целостность тканей органов-мишеней. Защита была связана со значительным повышением сывороточного IFNα и антител против вакцины IgM, модуляцией ответа IFNγ и сбалансированной активацией NK- и T-клеток. Агонисты TLR9 (CpG ODN) обладали меньшей защитой, чем агонист TLR3 поли (I: C). Мы показываем, что активация IFN типа 1 поли (I: C) и защита достижимы даже без совместной вакцинации, требующей достаточного количества вирусных антигенов инфекционного агента или вакцины.Это исследование продемонстрировало терапевтический потенциал постконтактной иммунной модуляции за счет активации TLR, что позволяет облегчить симптомы заболевания и еще больше расширить защитное окно постконтактной вакцинации.

Образец цитирования: Israely T, Melamed S, Achdout H, Erez N, Politi B, Waner T, et al. (2014) Агонисты TLR3 и TLR9 повышают эффективность вакцинации живыми противооспенными вакцинами после контакта. PLoS ONE 9 (10): e110545. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545

Редактор: Джозеф Дж. Маттапаллил, Университет силовых структур, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 8 июня 2014 г .; Принята к печати: 14 сентября 2014 г .; Опубликован: 28 октября 2014 г.

Авторские права: © 2014 Israely et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводов, полностью доступны без ограничений. Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа финансировалась внутренним институтом (Израильский институт биологических исследований). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Вирус натуральной оспы (VARV), возбудитель натуральной оспы, унес жизни сотен миллионов людей на протяжении всей истории до объявления Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) около трех десятилетий назад о том, что оспа искоренена. Это было достигнуто посредством всемирной кампании вакцинации с использованием вакцинных штаммов вируса осповакцины (VACV) и других близкородственных членов семьи [1]. Ликвидация болезни позволила постепенно прекратить кампанию вакцинации, что привело к увеличению доли неиммунизированных лиц во всем мире.Растущее беспокойство по поводу того, что оспа может возникнуть в результате случайного или преднамеренного высвобождения VARV, подчеркивает необходимость принятия эффективных контрмер после контакта (ч.э.), которые могут быть легко и быстро применены для массовой вакцинации [2].

Относительно длительный инкубационный период оспы человека, составляющий около 7–14 дней, открывает окно в несколько дней для необязательных р.э. вмешательство [3]. Анекдотические сообщения о защите p.e. вакцинация указывает на потенциальную пользу этого лечения [4].Используя вирус эктромелии (ECTV), возбудителя оспы мышей, мы вместе с другими продемонстрировали сходство различных аспектов заболевания между оспой мышей и оспой человека, обосновывая актуальность этой модели на животных для моделирования различных аспектов болезни человека и измерения степени заболеваемости. защита [5] — [9]. В этой животной модели p.e. методы лечения были исследованы с использованием различных вакцинных штаммов [8], противовирусных препаратов [7], [10], [11] и антител [12]. В соответствии с историческими исследованиями на людях вакцинация мышей VACV давала твердый p.е. защита при предоставлении до 3 дней p.e. при высокой дозе вакцинации [8]. Сопоставимые результаты были получены с вакциной MVA, сильно аттенуированной. Оба придают п.э. Однако вакцинация — единственный метод с одобренной эффективностью в искоренении оспы, обеспечивающий как краткосрочный, так и долгосрочный иммунитет.

Защита по п.э. Активная вакцинация требует индукции быстрого и мощного, но стойкого иммунного ответа. Несмотря на довольно длительный инкубационный период, уклонение от иммунитета хозяина этими вирулентными вирусами и скорость развития иммунитета (врожденного и адаптивного) снижает эффективность p.е. вакцинацию и ограничьте окно защиты первыми 3–4 днями р.э. Ранее мы показали, что, по крайней мере, на модели животных ECTV на мышах, эффективность p.e. на защиту с помощью активной вакцинации сильно влияет доза вакцины (предпочтительно 1 × 10 ⁸ БОЕ либо VACV-Lister, либо MVA) [8]. Неизвестно, актуально ли это и для людей, однако материально-технические последствия увеличения дозы вакцинации (для VACV) требуют альтернативного механизма быстрого индуцирования сильного иммунитета.Одним из возможных способов повышения эффективности иммунного ответа является совместное введение адъювантов с вакциной. Совместное введение адъювантов и вакцин перед воздействием широко используется в качестве одобренного протокола для усиления иммунного ответа на нерепликативные антигены: очищенные белки, ДНК или целые инактивированные вирусы или бактерии [13].

Семейство TLR, также известное как рецепторы распознавания образов (PRR), включает у людей 10 членов (TLR1-10) трансмембранных рецепторов, которые распознают молекулы общих консервативных паттернов (например,грамм. чужеродная ДНК, РНК, липосахариды и липопротеины) [14], [15]. Передача сигнала после активации рецептора опосредуется адапторными молекулами, такими как MyD88, TRIF, IRF3, IRF7 и IKK, которые запускают внутриклеточный каскад, приводящий к активации IFN-ответа I типа и / или секреции воспалительных цитокинов и усилению врожденного иммунитета против инвазивного возбудитель [16]. Эти рецепторы и их адаптеры играют важную роль в активации врожденного, а затем и адаптивного иммунитета.Специфичность TLR 3, 7, 8 и 9 к нуклеиновым кислотам (ДНК и РНК) и их эндосомная локализация позволяют обнаруживать вторгшиеся патогены и развивать иммунитет к вирусным инфекциям [17]. TLR9 обнаруживает неметилированные мотивы CpG, присутствующие с высокой частотой в ДНК микробов, а не млекопитающих [18], [19], и экспрессируется в основном плазматическими DC (pDC), B-клетками, моноцитами и зрелыми макрофагами, тогда как TLR3 (экспрессируется DC, B-клетками , эпителиальные и эндотелиальные клетки) запускается двухцепочечной РНК (дцРНК), продуцируемой во время репликации, главным образом, РНК-вирусов [20] — [22].Иммуностимулирующий эффект TLR3 и TLR9 может имитироваться синтетическими аналогами дцРНК (т.е. поли (I: C)) и олигонуклеотидами (т.е. ODN, содержащими мотивы CpG), соответственно. Были описаны три основных класса CpG ODN [16], [23] из которых мы исследовали в этом исследовании ODN типа «A», которые запускают pDC для производства IFN и тем самым активируют ответ T- и NK-клеток и «B». ODN типа, известный как сильный модулятор активации B-клеток.

Роль TLR в обнаружении бактериальных и вирусных компонентов и индукции иммунитета заложила основу для разработки и использования агонистов TLR в качестве молекулярных адъювантов для улучшения иммунного ответа вакцин [23].Примеры включают оценку лиганда TLR3 при гриппе [24]; и вакцины против вируса папилломы человека (HPV, [25]), лиганд TLR5 в вакцине против гриппа [26], [27], лиганд TLR9 в вакцине против малярии [28], [29] и лиганд TLR4 в вакцине против вируса гепатита B [30] ]. Некоторые из этих лигандов TLR находятся на стадии доклинических и клинических испытаний, в то время как AS04 (MPLA, агонист TLR4, содержащий квасцы) одобрен для клинического использования в качестве адъюванта вакцины против ВПЧ в Европе [31].

Геном поксвирусов представляет собой большую дцДНК (примерно 180–200 кбит / с), кодирующую около 200 ORF.Предварительная обработка противооспенной вакциной на основе белка, содержащей CpG-ODN и адъюванты квасцов [32] или QS-21 [33], улучшала иммуногенность и защиту, обеспечиваемые рекомбинантными белками без адъювантов. GM-CSF или E. coli термолабильный энтеротоксин (LT) усиливали защитные реакции антител на вакцину на основе гена 4pox у мышей [34]. Интересно, что также интраназальная вакцинация инактивированным вирусом осповакцины, приготовленным с поли (I: C), давала более высокий титр антител, чем вакцина без адъюванта, что позволяет предположить, что обнаружение чужеродных нуклеиновых кислот вызывает противовирусные иммунные ответы, независимо от точного состава их генетического материал [35].

Повышенная заболеваемость у инфицированных поксвирусом мышей с дефицитом TLR9 подчеркнула важность TLR9 для защиты от поксвирусных инфекций и развития специфического иммунитета к поксвирусу [36]. Кроме того, в рамках своей стратегии уклонения от иммунитета поксвирусы кодируют несколько белков вирулентности (N1, A52, A46), которые, как известно, ингибируют внутриклеточную передачу сигналов с помощью ряда TLR [37]. Важная роль TLR в приобретении быстрого иммунного ответа подчеркивает потенциальную пользу p.e. Активация TLR.

Независимо от специфичности лиганда TLR, до сих пор эти лиганды были приготовлены с белками или инактивированными вирусами и использовались в качестве адъювантов в вакцинах, вводимых в сценарии, предшествующем контакту. В настоящем исследовании мы оценили вклад совместно вводимых агонистов TLR в защитный иммунный ответ, вызываемый живыми вакцинами (VACV-Lister или MVA) в п.в. сценарий. Мы также показываем, что агонист TLR3 обеспечивает защиту даже без вакцин, но для этого требуется достаточное количество вирусных антигенов (инфекционного вируса).Такое лечение позволит защитить как краткосрочный, так и долгосрочный иммунитет. Насколько нам известно, это первый отчет о работе, посвященной изучению использования или применимости адъювантов, совместно вводимых с живыми вакцинами в ч.у. ситуация.

Материалы и методы

Клетки и вирусы

ECTV Moscow (ATCC VR-1374), VACV-Lister (Elstree; предоставлен Министерством здравоохранения Израиля) и клональный изолят MVA F6 на 584 ^{-м пассаже} CEF размножали и титровали, как описано ранее [8].ECTV, экспрессирующая люциферазу светлячков (ECTV-Luc) [38], была любезно предоставлена ​​профессором Луисом Сигалом из Исследовательского института онкологического центра Фокса Чейза, Филадельфия, США. Вкратце, ECTV Moscow и ECTV-Luc размножали в клетках HeLa (ATCC-CCL-2) и титровали на клетках BS-C-1 (ATCC-CCL-26). VACV-Lister размножали на хориоалантоисных мембранах эмбрионированных яиц и титровали на клетках Vero (ATCC-CCL-81). MVA размножали на вторичных фибробластах куриных эмбрионов и титровали на клетках BHK-21 (ATCC-CCL-10).

Эксперименты с заражением животных

Общие процедуры по уходу и содержанию животных соблюдались в соответствии с правилами проведения экспериментов на животных Израильского института биологических исследований (IIBR). Все протоколы экспериментов (M-45-2011, M-22-2012, M-52-2012 и M-05-2013) были одобрены IACUC (Институциональным комитетом по уходу за животными) IIBR до начала исследований. Были приложены все усилия, чтобы минимизировать страдания животных. Конечными точками были потеря веса (25% от исходного веса в инфицированных необработанных группах и 40% в обработанных группах) и / или неспособность реагировать на рефлекс выпрямления [39].Животных, достигших этих предопределенных конечных точек, гуманно приносили в жертву смещением шейного отдела позвоночника. Мышей взвешивали каждые 1–3 дня в течение первых двух недель, а затем каждые 2–5 дней до конца эксперимента (25–30-е сутки). Когда мышей теряли в весе более чем на 20%, проводилось взвешивание индивидуумов на ежедневной основе. Все заражения и обработки выполняли один раз на анестезированных мышах (кетамин 75 мг / кг, ксилазин 7,5 мг / кг в PBS). Неинфицированные необработанные и инфицированные необработанные группы служили во всех экспериментах в качестве контроля.Обработка плацебо проводилась с PBS. Количество мышей в группе для каждого эксперимента указано в таблицах или в подписях к соответствующим рисункам. Мышей содержали в 12-часовом цикле свет-темнота, причем темновой цикл начинался с 19:00. до 7∶00 утра с ad libitum продуктами питания и водой. Мышей содержали в особой среде, свободной от патогенов, в индивидуально вентилируемых клетках (IVC). Перед каждым экспериментом мышей случайным образом делили на экспериментальные группы по 3–6 животных для получения достоверных статистических данных.

Самок мышей BALB / c (возраст 6-8 недель, 15-18 граммов) были приобретены в Charles River Laboratories, Маргейт, Великобритания. Самок мышей C57BL / 6j (возраст 6-8 недель, 15-18 граммов) были приобретены в лаборатории Джексона (мыши JAX, Массачусетс). За неделю до эксперимента мышей акклиматизировали под наблюдением. Для интраназального (i.n.) заражения мышей анестезировали и вводили ECTV (20 мкл) путем закапывания в одну из ноздрей.

В экспериментах BALB / c контрольная доза варьировала от 4 до 20 ECTV LD ₅₀ (1 БОЕ = 1 LD ₅₀ ; всего 4 эксперимента), а у мышей C57BL / 6j контрольная доза варьировала от 2 до 3. ECTV LD ₅₀ (250 БОЕ = 1 LD ₅₀ ; всего 2 эксперимента).ECTV-Luc использовали для исследования биолюминесценции на мышах BALB / c. Мышей инфицировали 2 в / н. LD ₅₀ (7 БОЕ = 1 i.n. LD ₅₀ ), оставленный без лечения (n = 5) или обработанный поли (I: C) на 3 день р.э. (n = 3) и сканировали на 7, 8, 14 и 16 дни p.e.

Poly (I: C) (высокомолекулярный, InvivoGen, CA) и CpG-олигонуклеотиды ODN 1826 и ODN 1585 (типа B и A, соответственно; InvivoGen, CA) были приготовлены в соответствии с инструкциями производителя, разделены на аликвоты и заморожены (-20 ° C) для дальнейшего использования.

Вакцинацию с помощью VACV-Lister (i.d. скарификация хвоста, 1 × 10 ⁶ БОЕ в 10 мкл) или MVA (внутримышечно, 1 × 10 ⁸ БОЕ в 50 мкл) проводили, как описано ранее [7]. Поли (I: C) вводили подкожно. у основания хвоста (100 мкг в 100 мкл). CPG-ODN 1826 и CPG-ODN 1585 вводили подкожно. на сайте i.d. скарификация хвоста (50 мкг в 10 мкл). Эти агонисты TLR вводили либо отдельно, либо одновременно с вакцинами.

Во всех случаях лечение было дано анестезированным мышам один раз в качестве единой обработки.

Приготовление сыворотки и определение вирусной нагрузки в органах мыши

Вирусные нагрузки ECTV в селезенке, печени и легких определяли у мышей в течение 8 дней p.e. как описано ранее [7]. Перед удалением органа у мышей брали кровь из хвостовой вены, и сыворотку отделяли в пробирках для разделения (BD Microtainer, UK) после центрифугирования (10600 g) и держали при -20 ° C.

Биолюминесцентная визуализация

Получение изображений в реальном времени было выполнено с помощью системы IVIS Lumina II (Caliper LifeSciences, Массачусетс).Субстрат D-люциферина (Caliper LifeSciences, MA) вводили внутрибрюшинно (i.p.) (150 мкг / г веса тела) за 7 минут до визуализации. Мышей визуализировали под анестезией с использованием кетамина 75 мг / кг, ксилазина 7,5 мг / кг в PBS. Мышей получали изображения на 7, 8, 14 и 16 дни после операции. Изображения собирали в течение 1 или 40 с с коэффициентом объединения 4. Для всех исследованных мышей использовали одну и ту же область интереса (ROI) для расчета интенсивности сигнала (от груди до задних конечностей). Излучение света измерялось в фотонах / с / см2 / ср (поток фотонов).Сбор и анализ были выполнены с помощью программного обеспечения Living Image, версия 4.2 (Calliper LifeSciences, Хопкинтон, Массачусетс).

Количественное определение IFN-γ и IFN-α

Концентрация IFN-γ в сыворотке измерялась через 8 дней p.e. с использованием набора Quantikine Mouse IFN-γ Immunoassay Kit в соответствии с инструкциями производителя (R&D Systems, MN) и как описано ранее [7]. Концентрации IFN-α в сыворотке (через 1 день после лечения или в соответствующие дни p.e. в инфицированной необработанной группе) измеряли с использованием набора VeriKine для ELISA мышиного IFN-α в соответствии с инструкциями производителя (PBL InterferonSource, NJ).

Определение титра антител IgM

Титры специфических IgM антител к осповакцине определяли у мышей, начиная с 8-го дня p.e. SERA с помощью ELISA. 96-луночные микротитрационные планшеты покрывали в течение ночи VACV WR (1 × 10 ⁷ БОЕ / мл, 100 мкл / лунку, 4 ° C). Вирус инактивировали с использованием 3,7% параформальдегида в течение 10 минут при комнатной температуре (50 мкл / лунку для конечной концентрации 2,4%) с последующими 3 промываниями в промывочном буфере (0,05% Tween 20 в PBS). Образцы в конечном разведении 1∶200 в TSTA (50 мМ Tris pH 7.6, 142 мМ NaCl, 0,05% азида, 0,05% Твин 20 и 2% БСА) добавляли в планшет на 1 час при 37 ° C после блокирования TSTA в течение 1 часа при 37 ° C. Конъюгированный с щелочной фосфатазой козий антимышиный IgM, разведенный 1-1000 в TSTA (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. PA), добавляли после 3 промывок и инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C. P- нитрофенилфосфатный субстрат (Sigma, Миссури) добавляли после 3 промывок и измеряли оптическую плотность (ридер для микропланшетов Spectramax 190, Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, О.D. 405 нм) после 60 мин инкубации при комнатной температуре. Значения IgM определяли путем вычитания удвоенного значения буферной контрольной лунки из исследуемого образца.

Окрашивание поверхностных и внутриклеточных цитокинов

Мышиные спленоциты окрашивали на внеклеточные маркеры с последующим внутриклеточным окрашиванием (ICS) с использованием набора Cytofix / Cytoperm, содержащего монензин (BD Biosciences, NC), в соответствии с инструкциями производителя. В качестве антител использовали анти-CD3ε (клон 145-2C11), анти-CD8α (клон 53-6.7), анти-CD4 (клон RM4-5), анти-DX5 (клон DX5) и анти-IFNγ (клон XMG 1.2, все от e-Bioscience). Сбор данных выполняли с помощью проточного цитометра FACSCalibur (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo 7.6 (Tristar, Калифорния). Общее количество клеток NK, CD3 ⁺ , CD4 ⁺ и CD3 ⁺ CD8 ⁺ в селезенке определяли путем умножения процентного содержания каждого типа клеток на общее количество клеток, выделенных из органа.

Гистология и иммуногистохимия

Образцы тканей (легкие, селезенка и печень) фиксировали 4% параформальдегидом в PBS в течение 7–14 дней, переносили в 70% этанол, заливали парафином, делали серийные срезы (толщиной 5 мкм) и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E ).Для обнаружения ECTV срезы после извлечения антигена (10 мМ цитратный буфер, 0,05% Tween-20, pH 6,0 в течение 20 минут при 95–100 ° C) обрабатывали в соответствии с процедурой, рекомендованной производителем, с использованием наших собственных кроличьих антибиотиков. Антитело -ECTV, разведенное 1-250 в PBS + 1% BSA (EnVision + System-HRP (DAB) для использования с первичными антителами кролика, DAKO, Carpinteria, CA). Окрашивание CD45 выполняли с использованием биотинилированного крысиного антитела против CD-45 мыши (R&D systems, MN) после извлечения антигена. Набор для окрашивания клеток и тканей для крыс, систему HRP-DAB использовали для усиления сигнала (R&D systems, MN).Контркрашивание гематоксилином проводилось на всех предметных стеклах.

Анализ данных

графиков выживаемости Каплана-Мейера сравнивали с помощью теста Кокса-Мантеля. Анализ заболеваемости проводился как среднее значение площади под кривой (AUC) в процентах от индивидуального веса на исходном уровне, как описано ранее [40]. Вкратце, AUC была взвешена с продолжительностью периода наблюдения, начиная со дня заражения (день 0) до конца эксперимента (день 25-30) или дня смерти животного.Различия между группами анализировали с помощью теста Стьюдента t . Анализ Манна-Уитни был проведен для сравнения данных вирусной нагрузки между группами. Летальная доза 50% для мышей BALB / c и C57BL / 6j была рассчитана согласно Reed et. al. [41]. Сообщенные значения p <0,05 считались значимыми. На протяжении всей рукописи средние данные представлены как среднее значение (± стандартная ошибка среднего (SEM)). Для корреляции IFNγ - вирусная нагрузка использовалась линейная регрессия, тогда как для корреляции IFNγ - IgM была проведена нелинейная аппроксимация по экспоненциальной кривой роста.Статистические данные были выполнены с использованием GraphPad Prism 5 для Windows (версия 5.00, GrapPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния).

Результаты

Расширение терапевтического окна постконтактной вакцинации за счет совместного введения агонистов TLR3 и TLR9

Чтобы оценить способность агонистов TLR9 и TLR3 увеличивать терапевтический потенциал вакцинации после контакта, мы использовали установленную модель инфекции ECTV на мышах [7], [10], [11]. Мыши BALB / c, инфицированные смертельной дозой ECTV, проявляли признаки болезни (потеря веса (рис. 1 A), шерсть) начиная с 7-8 дней.е. и умерли от инфекции в течение среднего времени до смерти (MTTD) 11,3 ± 3,4 дня. Мыши, получавшие плацебо (PBS), умерли от инфекции так же, как и инфицированная необработанная группа (MTTD 10,7 ± 1,2 и 11,2 ± 2,7 на 2-й и 3-й день соответственно). В этих условиях вакцинация VACV-Lister не защищала мышей (таблица 1, 8% на 2-й день и 0% на 3-й день p.e., Рисунок 1 C, D). Совместное введение агонистов TLR9, CpG 1826 (тип B) или CpG 1585 (тип A) с вакциной на 2-й или 3-й день p.e. обеспечивает значительную защиту (Таблица 1, Рисунок 1 A, B).Введение CpG 1585 без вакцины обеспечивало частичную защиту, в то время как введение CpG 1826 не было защитным (таблица 1, фигура 1 A, B).

Рис. 1. Заболеваемость, основанная на изменении веса после лечения мышей BALB / c после воздействия (р.э.).

Мышей инфицировали 4–20 i.n. ЭЦТВ ЛД ₅₀ . (A, B) Лечение CPG с VACV-Lister или без него на 2 (A) и 3 (B) день р.э. (C) Обработка поли (I: C) с использованием или без VACV-Lister или только VACV-Lister на 2 день p.e.(D) Обработка поли (I: C) с использованием VACV-Lister или MVA или без них и лечение только вакцинами на 3 день p.e. (E, F) Обработка поли (I: C) с или без VACV-Lister или MVA и только MVA в дни 4 (E) и 5 ​​(F) p.e. Звездочка обозначает значительную разницу в площади под кривой изменения веса на протяжении всего эксперимента для обработанных групп по сравнению с инфицированной необработанной группой (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, * *** P <0,0001, t -тест). Показан сбор данных для каждого лечения (изменение веса (среднее, стандартное отклонение)).Показана заболеваемость инфицированных необработанных мышей из соответствующих соответствующих экспериментов. Количество мышей, умерших от инфекции в каждый момент времени, обведено цветом в рамке над каждым графиком. Выжившие из общего числа мышей в каждой группе обозначены цветом рядом с легендой.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g001

Затем мы оценили защитный эффект агониста TLR3 (РНК) поли (I: C). Совместное введение поли (I: C) с вакциной предотвратило смерть 83%, 89%, 80% или 67% мышей, получавших лечение на 2, 3, 4 или 5 дни, соответственно (P <0.0001 на 2, 3, 4 дни и P <0,01 на 5 день по сравнению с инфицированными необработанными мышами, таблица 1). Интересно, что введение поли (I: C) без вакцины также предотвратило смерть (67%, 83% или 100% мышей на 2, 3 или 4 дни соответственно (P <0,05 на 2 день и P <0,0001 на 3 день). и 4 по сравнению с инфицированными необработанными мышами)), однако статистически значимая защита на 5 день была достигнута только тогда, когда поли (I: C) был объединен с вакциной. Подобно лигандам TLR9, показатели смертности отражали степень заболеваемости.Обработка поли (I: C) препаратом VACV-Lister, назначенная на 2, 3, 4 или 5 день, отсрочила и значительно уменьшила степень потери веса (P <0,0001 для 2, 3, 4 дней и P <0,05 для дня). 5, рис. 1 C – F)).

В отличие от VACV-Lister, MVA не реплицируется в организме млекопитающих-хозяевах, что, с одной стороны, делает MVA безопасной вакциной, но с другой стороны требует 100-кратного увеличения дозы вакцины. Чтобы оценить эффективность совместного введения поли (I: C) и MVA, мышей BALB / c р.э. вакцинированы MVA (1 × 10 ⁸ БОЕ i.м) с поли (I: C) (s.c.) или без него. Вакцинация MVA 3 дня р.э. защищали 45% мышей, в то время как вакцинация в дни 4 или 5 больше не обеспечивала защиты (Таблица 1, 0% на 4 день и 8% на 5 день, Рисунок 1 D – F). Совместное введение поли (I: C) и MVA улучшило защиту до 100%, 53% и 33% на 3, 4 и 5 дни соответственно (P <0,0001 для 3-го дня, P <0,05 для 4-го дня и P = 0,3. на 5-й день по сравнению с инфицированными, не получавшими лечения). Совместное защитное введение MVA и поли (I: C) снизило заболеваемость по сравнению с незащищенными мышами (P <0.0001, P = 0,08 и P = 0,4 для 3, 4 и 5 дней соответственно; Рисунок 1D – F). Совместное введение поли (I: C) и MVA не имело преимуществ перед поли (I: C) (таблица 1, рисунок 1).

Подобные эксперименты были выполнены с мышами C57BL / 6j, которые отличаются от BALB / c по чувствительности к инфекции ECTV (i.n. LD ₅₀ в BALB / c составляет 1 БОЕ, а в C57BL / 6j — 250 БОЕ). Мышам вводили 2–3 внутривенных инъекций. LD ₅₀ ECTV (MTTD инфицированных необработанных: 11,2 ± 1,9 дня) и обработанных в дни 0, 1 или 2 p.е. В то время как VACV-Lister не защищал ни в день 0, ни в день 1, комбинация поли (I: C) и VACV-Lister обеспечивала значительную защиту (55% и 45% выживаемость в дни 0 и 1, P <0,0001 в обоих случаях). случаев по сравнению с инфицированными необработанными мышами, таблица 2). Совместное введение поли (I: C) и MVA в течение одного или двух дней p.e. также улучшало защиту по сравнению с защитой, достигнутой только с помощью MVA (день 1 с 72% до 100%; день 2 с 18% до 55%). Совместное защитное введение поли (I: C) и VACV-Lister или MVA не предотвращало ухудшение заболеваемости в течение первых 10 дней p.е. но предотвратил дальнейшее ухудшение состояния и смерть (рисунок S1, P <0,01 для VACV-Lister + poly (I: C) и P <0,001 для MVA + poly (I: C) на основании анализа AUC по сравнению с инфицированными, не получавшими лечения или только вакцинированными). Введение только поли (I: C) в день 1 p.e. защищали 43% мышей (P <0,0001 по сравнению с инфицированными необработанными мышами).

Соотношение эффективных методов лечения со снижением вирусной нагрузки на периферические органы

Для дальнейшей разработки механизма защиты, обеспечиваемой адъювантами, мы оценили эффект поли (I: C) на распространение ECTV in vivo на .Мышей BALB / c инфицировали интраназально летальной дозой ECTV, экспрессирующей люциферазу светлячка (ECTV-Luc, 2 LD ₅₀ ), и поток фотонов определяли с использованием устройства для визуализации биолюминесценции (IVIS Lumina II). Анализ данных показал, что в течение 7-8 дней ECTV-Luc эффективно распространяется в легкие, печень и селезенку, определяемую как область интереса (ROI) (рис. 2 A). Биолюминесцентный анализ на 7, 8 дни (рис. 2 Б), 14 и 16 п.э. (Рисунок 2 C) показал, что обработка поли (I: C) на 3-й день значительно снижает интенсивность сигнала в области интереса на 2–3 log по сравнению с сигналом у инфицированных необработанных мышей (Рисунок 2 D, P <0.05 в течение 7 и 8 дней) в соответствии с улучшенной защитой, индуцированной поли (I: C) у мышей, инфицированных ECTV-Moscow (Таблица 1). Восстановление после лечения поли (I: C) (день 16 pe, рис. 2 C) было связано с увеличением веса, улучшением состояния животных и неопределяемым вирусом в селезенке (<75 БОЕ / селезенка) и печени (<750 БОЕ / печень). . Несмотря на то, что биолюминесцентный сигнал от легкого не определялся через 16 дней, очень низкая вирусная нагрузка 4,9 × 10 ³ ± 3,0 × 10 ³ БОЕ / легкое все же была обнаружена с помощью анализов на бляшках (рис. 2 D).

Рисунок 2. Влияние обработки Poly (I: C) на распространение вируса, оцененное с помощью in vivo биолюминесцентной визуализации.

Мышей BALB / c инфицировали 2 i.n. ECTV-Luc LD ₅₀ и оставлено без лечения (n = 5) или обработано поли (I: C) на 3 день p.e. (n = 3). (A) Зараженные нелеченые мыши 8 дней р.е. (B) Зараженные мыши, получавшие лечение на 3 день р.э. с поли (I: C) и изображение на 8-й день p.e. (C) Группа, обработанная поли (I: C), на 3 день p.e. снято на 16 день р.э. Биолюминесцентные изображения были получены с использованием диафрагмы 1, коэффициента объединения 4 и времени получения 1 сек (A, B) или 40 секунд (C).Выражение относительного потока фотонов представлено псевдоцветной тепловой картой. (D) Заболеваемость, основанная на изменении веса (линии, левая ось Y) и сигнале биолюминесценции на 7, 8, 14 и 16 дни p.e. (столбцы, правая ось Y) групп, показанных на панелях A – C (красный для инфицированных, не получавших лечения, черный для поли (I: C), обработанных на 3 день p.e.). Интенсивность биолюминесцентного сигнала как общий поток фотонов (фотон / с / см2 / ср) рассчитывалась с помощью анализа области интереса (ROI) на груди и области живота, отмеченной белым квадратом на правой мыши на панели (A).Для всех исследованных мышей использовалась одинаковая ROI. Звездочка означает значительное снижение потока фотонов (n = 3–5 в каждой группе, P <0,05). Кинжал олицетворяет мертвых мышей.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g002

Для дальнейшей оценки эффективности лечения мышей BALB / c умерщвляли на 8 день p.e. и вирусные нагрузки в легких, печени и селезенке. В периферических вторичных органах вирусная нагрузка в зараженной нелеченой группе достигала 2.9 × 10 ⁷ БОЕ / печень и 2,0 × 10 ⁸ БОЕ / селезенка (Geomean, рис. 3 A, C). Вакцинация VACV-Lister 2 или 3 дня р.э. не оказали влияния на вирусную нагрузку, обнаруженную в селезенке или печени (рис. 3 A – D). Лечение поли (I: C), проводимое с вакцинацией VACV-Lister или без нее на 2-й день p.e. значительно снизили вирусную нагрузку в печени и селезенке (P <0,05 по сравнению с инфицированной нелеченой группой). Это снижение было дополнительно усилено, когда лечение Poly (I: C) проводилось на 3-й день. Корреляция между защитой и сниженной вирусной нагрузкой в ​​селезенке и печени была также обнаружена после совместного введения вакцины VACV-Lister и CpG 1826, введенного в день. 2 или 3 (Рисунок 3 A – D).Ни один из упомянутых выше методов лечения не снизил вирусную нагрузку в легких (рис. 3 E – F). Аналогичные результаты были получены на мышах C57BL / 6j (рис. S2).

Рис. 3. Вирусная нагрузка после обработки после контакта.

Вирусную нагрузку определяли с помощью анализа бляшек у мышей BALB / c через 8 дней после контакта (p.e.) после заражения 18 i.n. ЭЦТВ ЛД ₅₀ . (A, C, E) вирусная нагрузка в печени, селезенке и легких мышей, получавших лечение на 2 день p.e. (B, D, E) вирусная нагрузка в печени, селезенке и легких мышей, получавших лечение на 3-й день p.е. Горизонтальные линии представляют собой среднее геометрическое для каждой группы. Обозначены выживаемость каждой группы. Звездочка означает значительное снижение вирусной нагрузки (n = 3 в каждой обработанной группе) по сравнению с инфицированной необработанной группой (n = 6, P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g003

Эффективное лечение поли (I: C) коррелирует со снижением уровня IFNγ в сыворотке на поздних стадиях заболевания и предотвращением повреждения тканей

После летального заражения вирусом натуральной оспы не относящихся к человеку приматов уровень IFN-гамма (IFNγ) повышается на поздних конечных стадиях болезни примерно на 3 порядка по сравнению с уровнем цитокинов у наивных животных [42].Мы количественно оценили уровень IFNγ в сыворотке мышей BALB / c, собранной на 8 день p.e. В этот момент инфицированные нелеченые мыши находились на поздних стадиях заболевания, что зависело от их потери веса и вирусной нагрузки в различных органах. В то время как сывороточный уровень IFNγ у наивных мышей составлял 11,9 ± 1,0 пг / мл, у инфицированных необработанных мышей BALB / c уровни IFNγ достигали 77 800 ± 13 000 пг / мл (рис. 4 A). Подобные уровни были также обнаружены у инфицированных мышей, вакцинированных VACV-Lister или обработанных плацебо. Введение поли (I: C) на 3-й день р.е., либо отдельно, либо с вакциной, которая обеспечивала защиту 83% и 89% соответственно, приводила к значительному снижению уровня IFNγ (2461 ± 957 пг / мл для VACV-Lister + poly (I: C) и 4 166 ± 1135 пг / мл только для поли (I: C), фиг. 4 A, P <0,01 по сравнению с инфицированной необработанной группой).

Рис. 4. Изменения уровней IFNγ в сыворотке после р.э. лечения.

Уровни IFNγ определяли через 8 дней p.e. (A) Мышей BALB / c инфицировали 5–18 i.n. ECTV LD ₅₀ и лечили на 3 день р.е. с VACV-Lister (n = 6), VACV-Lister и Poly (I: C) (n = 6), Poly (I: C) (n = 6) или плацебо (PBS, n = 3). Звездочка указывает на значительную разницу (P <0,05, n = 9 в инфицированной необработанной группе). (B) Мышей C57BL / 6j инфицировали 2–3 вв. ECTV LD ₅₀ и лечение в дни 0–2 p.e. с Poly (I: C) с VACV-Lister или MVA или без них и только вакцинами (n = 3–6 в каждой группе). Звездочка указывает на значительную разницу в уровнях IFNγ по сравнению с инфицированной необработанной группой (n = 9, P <0.05). Для каждой экспериментальной группы процентные значения защиты указаны над каждой полосой (%), которая относится к данным, собранным для всех аналогичных групп обработки (таблицы 1 и 2). Наивные мыши BALB / c (n = 5) и C57BL / 6j (n = 4) имели значения IFNγ 11,9 ± 1,0 пг / мл и 8,0 ± 0,8 пг / мл соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g004

Анализ IFNγ у мышей C57BL / 6j показал аналогичное поведение с BALB / c, но при этом величина ответа (изменения IFNγ) на инфекцию ECTV и к защитному лечению был более устойчивым у мышей BALB / c (рис. 4 B).Комбинированное лечение VACV-Lister или MVA с поли (I: C), а также введение только поли (I: C) было связано со снижением уровней IFNγ в соответствии с улучшенной выживаемостью.

Уровни IFNγ в сыворотке на 8 день pe положительно коррелировали с вирусной нагрузкой в ​​селезенке и печени для каждой линии мышей в обеих линиях мышей (Рисунок 5 A – D, лечение на 2–3 дни; R ² указаны рядом с каждым графиком, P <0,0001 во всех случаях). С другой стороны, на вирусную нагрузку в легких лечение не повлияло, и, следовательно, уровни IFNγ в сыворотке не коррелировали с вирусной нагрузкой в ​​легких (рис. 5 E, F).Кроме того, распределение диапазона IFNγ у мышей BALB / c было шире, чем у C57BL / 6j, что позволило определить пороговые значения, которые могут позволить различать успешный (<700 пг / мл) и неэффективный (> 100000 пг / мл). мл) лечение.

Рис. 5. Корреляция между IFNγ и вирусной нагрузкой.

(A, C, E) Вирусные нагрузки и уровни IFNγ у мышей BALB / c, инфицированных 18 i.n. ECTV LD ₅₀ , необработанные (n = 6) или однократно обработанные на 2 или 3 день с помощью: поли (I: C) с или без VACV-Lister, CpG-ODN 1585 и 1826 с или без VACV-Lister и VACV- Только листер (n = 3 / группа).(B, D, F) Вирусная нагрузка и уровни IFNγ у мышей C57BL / 6j, инфицированных 2–3 i.n. ECTV LD ₅₀ , необработанные (n = 6) или однократно обработанные в день 0: поли (I: C) с или без VACV-Lister, VACV-Lister или плацебо; день 1: поли (I: C) с или без VACV-Lister или MVA, VACV-Lister или MVA, плацебо; день 2: поли (I: C) с или без MVA (n = 3 / группа), MVA или плацебо (n = 3 / группа). (А, В) селезенки; (C, D) печень и (E, F) легкие. Зеленые точки — обследованные мыши из групп, в которых выживаемость составляла 50% и выше.Красные точки — обследованные мыши из групп, в которых выживаемость была менее 50% (n = 48 либо для BALB / c, либо для C57BL / 6j).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g005

Для изучения патологического воздействия инфекции на органы-мишени мы выполнили гистопатологическое исследование селезенки, печени и легких леченых (на 3-й день) vs. инфицированные нелеченые мыши на 8-й день Селезенки инфицированных необработанных мышей (или мышей, получавших только VACV-Lister) демонстрировали серьезное разрушение ткани и полную потерю структуры ткани.Белая пульпа была в основном разрушена, и по всей селезенке наблюдались некроз лимфоцитов и наличие кариорексиса (рис. 6 A, D). Лимфоциты (положительно окрашенные на CD45) появились в остатках белой пульпы (рис. 6 B, E), тогда как иммуногистохимические срезы были положительно окрашены на вирусные антигены ECTV по всей некротической ткани (рис. 6 C, F). Напротив, селезенки мышей, получавших комбинированное лечение поли (I: C) — VACV-Lister, показали нормальную морфологию, которая сопровождалась типичной архитектурой белой пульпы (положительно окрашенной CD45) и неопределяемыми вирусными антигенами (рис. 6 G – I). ).Селезенки мышей, получавших поли (I: C), имели ту же морфологию, что и в группе комбинированного лечения (рис. 6 I – L), за исключением нескольких небольших некротических очагов, которые были положительными для вирусных антигенов и отрицательными для клеток CD45 (рис. S3).

Рисунок 6. Эффект п.э. обработки селезенки инфицированных мышей.

Селезенки вскрывали через 8 дней р.э. от обработанных мышей (через 3 дня после лечения) (A – C, G – L), от необработанных (D – F) или от незараженных наивных мышей (M – O). Левый столбец — окраска гематоксилином и эозином (H&E), средний столбец — CD45 (коричневое окрашивание лейкоцитов), правый столбец — вирусные антигены (коричневое окрашивание).Серийные разделы (A – C) лечения VACV-Lister; (D – F) инфицированные без лечения; (G – I) лечение поли (I: C) и VACV-Lister и (J – L) лечение поли (I: C). Увеличение на всех изображениях: X40.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g006

Гистопатологическое исследование также проводилось на печени обработанных и необработанных мышей. В то время как у мышей, получавших комбинированный VACV-Lister — поли (I: C) и поли (I: C), наблюдалась только легкая или умеренная диффузная гепатоцитарная вакуолярная дегенерация, у инфицированных необработанных мышей и мышей VACV-Lister в печени наблюдалась мультифокальная гепатоцитарная активность. некротические очаги по всей печени и массивное окрашивание на ECTV (Рисунок S4).Легкие мышей, получавших только поли (I: C) или комбинированные с VACV-Lister, имели нормальную морфологию ткани, в то время как легкие признаки интерстициальной пневмонии наблюдались в легких инфицированной необработанной или только группы, обработанной VACV-Lister. В группе, получавшей Lister, в легких было обнаружено повышенное количество нейтрофилов (данные не показаны).

Модуляция адаптивного иммунного ответа после введения Poly (I: C)

Продемонстрировав, что пролиферация и распространение ECTV на органы-мишени снижается после введения поли (I: C), мы дополнительно исследовали влияние лечения на иммунный ответ.Введение поли (I: C) на 2-й или 3-й день после операции индуцировало более высокие уровни специфических IgM к поксвирусу в сыворотке мышей BALB / c при измерении на 8-й день после каждого дня. (Рисунок 7A, P <0,01 по сравнению с инфицированной необработанной группой) независимо от того, вводили ли VACV-Lister одновременно. Титры IgM были ниже предела обнаружения у инфицированных необработанных, обработанных плацебо или вакцинированных VACV-Lister мышей. Твердая защита (67% и выше) была связана с высоким титром антител IgM.

Рисунок 7. Корреляция уровней IgM и эффективности лечения.

(A) Уровень IgM в сыворотке мышей BALB / c, собранный через 8 дней после внутривенного введения. инфицирование 18 LD ₅₀ ECTV определяли с помощью ELISA. Пропорции выживаемости каждой группы указаны над каждой полосой. Звездочка обозначает значимое различие по сравнению с инфицированной необработанной группой (P <0,01, n = 6 в инфицированной необработанной группе, n = 3 в обработанных группах, t -тест). Пунктирная линия обозначает предел обнаружения. (B) Корреляция между уровнями IFNγ и IgM у мышей, представленных на панели A.Зеленые кружки — обследованные мыши из групп, в которых выживаемость составляла 50% и выше. Красные треугольники — обследовали мышей из групп, в которых выживаемость была менее 50%. Значение R ² представляет собой нелинейную подгонку.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g007

Поскольку известно, что продукция IFNγ отменяет выработку иммуноглобулинов (включая IgM, [43], [44]), мы исследовали, наблюдаемые изменения в ответе IgM коррелировали с уровнем IFNγ (оба обследованы с 8 дня р.е. сыворотки мышей). Действительно, мы обнаружили, что высокие уровни IFNγ отрицательно коррелировали с титрами специфических IgM к поксвирусу (рис. 7 B, R ² = 0,71).

Для дальнейшей характеристики клеточно-иммунного ответа после п.э. При адъювантном введении мышам BALB / c прививали летальную дозу ECTV (4LD ₅₀ ), вводили поли (I: C) на 3-й день, и эффект количественно оценивали на основе количества и активации естественных киллеров (NK) как а также CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки на 8 день p.е. (т.е. через 5 дней после лечения). Гросс-морфологическое сравнение выявило увеличенные селезенки у инфицированных мышей, получавших поли (I: C), с VACV-Lister или без него, в то время как селезенки инфицированных мышей, вакцинированных VACV-Lister или оставленных без лечения, выглядели меньше и имели мозаичный негомогенный вид в отличие от селезенки мышей, которым вводили поли (I: C), которая выглядела нормальной (фигура 8 A). Действительно, количество общих лимфоцитов в относительно небольших селезенках было ниже, чем в селезенках наивных мышей, тогда как обработка поли (I: C) коррелировала с увеличением количества лимфоцитов в селезенке (фигура 8 B).Уменьшение общего количества лимфоцитов сопровождалось уменьшением количества NK-клеток, CD3 ⁺ CD4 ⁺ и CD3 ⁺ CD8 ⁺ Т-клеток. (Рисунок 8C, E, G соответственно). Напротив, обработка поли (I: C) привела к увеличению количества NK-клеток (фигура 8 C). Дальнейший анализ активации лимфоцитов показал, что обработка поли (I: C) индуцировала активацию NK-клеток, CD3 + CD8 + и CD3 + CD4 + Т-клеток, как показано внутриклеточным окрашиванием на IFNγ (фиг. 8 D, F, H).В то время как активация лимфоцитов у мышей, получавших поли (I: C), затрагивала как Т-клетки CD4, так и CD8, а также NK-клетки, необработанные мыши или мыши, вакцинированные VACV-Lister, демонстрировали дифференциальную активацию только CD3 + CD8 + Т-клеток. Таким образом, прочная защита была связана с организованной активацией CD3 ⁺ CD8 ⁺ , NK и CD3 ⁺ CD4 ⁺ клеток.

Рис. 8. Клеточно-иммунный ответ после п.э. лечение.

мышей BALB / c инфицировали 4 i.п. ECTV LD ₅₀ , не лечили или лечили на 3-й день р.э. и их селезенки были сфотографированы (A) и проанализированы с помощью проточной цитометрии на распределение и активацию (внутриклеточный IFNγ) различных популяций клеток. (B) Подсчет жизнеспособных лимфоцитов проводился под световым микроскопом. (C – H) Количество общих и активированных клеток различных популяций клеток: NK (C, D), CD3 ⁺ CD4 ⁺ (E, F) и CD3 ⁺ CD8 ⁺ (G, H) клетки соответственно.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g008

Poly (I: C) способствует защите посредством TLR3 и индукции IFNα типа 1

Связывание поли (I: C) с TLR3 приводит к активации рецептора и синтезу IFN типа I. Чтобы оценить противовирусный иммунный ответ после введения поли (I: C), мы количественно оценили эффект введения поли (I: C) на продукцию IFNα путем измерения его концентрации в сыворотке неинфицированных наивных мышей. Введение поли (I: C) привело через 24 часа к значительному увеличению уровня сывороточного IFNα на три порядка (888.1 пг / мл против 8,5 пг / мл, P <0,01, рис. 9 A, вставка).

Фигура 9. Повышение уровней IFN-α после введения Poly (I: C).

IFN-α исследовали в сыворотке мышей BALB / c. (Вставка) Сыворотки неинфицированных наивных мышей до (n = 2) и через 24 часа после введения поли (I: C) (n = 6). IFN-α в сыворотке 20 i.n. LD ₅₀ ECTV (A) инфицированных необработанных мышей, обследованных на 4-й день (n = 6), 5 (n = 3) или 6 (n = 3) p.e. или через 24 часа после лечения препаратом VACV-Lister, введенным на 3-й день, MVA на 3-й, 4-й или 5-й день или плацебо на 3, 4 или 5 день (n = 3 во всех группах).(B) IFN-α в сыворотке мышей через 24 часа после обработки поли (I: C) на 3, 4 или 5 дни отдельно или в комбинации с VACV-Lister или MVA (n = 3-5 / группа).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.g009

Поскольку инфекция ECTV влияет на иммунитет хозяина, включая ответ IFN типа I [37], мы определили уровни IFNα в сыворотке крови у инфицированных мышей после введенных обработок 3, 4 или 5 дней pe (Рисунок 9 A, B). Уровень IFNα оставался низким (<54 пг / мл) у мышей, инфицированных ECTV, которые не получали лечения или вакцинировались VACV-Lister или MVA (фигура 9 A).Напротив, введение поли (I: C) с вакцинами или без них приводило к повышенным уровням IFNα в диапазоне от 310 до 2660 пг / мл (фиг.9 B). Обработка поли (I: C) с вакциной или без нее, вводимая на 3-й день p.e. индуцировал значительно более высокие уровни IFNα по сравнению с инфицированной необработанной группой в тот же момент времени (день 4 p.e., P <0,01, фиг.9 A, B). Совместное введение VACV-Lister или MVA поддерживало способность поли (I: C) индуцировать IFNα. Индукция IFNα была связана с улучшением статистической выживаемости в этих группах (таблица 1).Прогрессирование заболевания препятствовало способности поли (I: C) индуцировать IFNα, что приводило к снижению ответа IFNα на 4 или 5 день по сравнению с 3 днем ​​(фигура 9 B).

Наконец, мы исследовали, достаточно ли индукции IFNα поли (I: C) для защиты мышей от последующей инфекции ECTV. С этой целью мышам вводили поли (I: C) за день до или в день воздействия (20 ECTV i.n. LD ₅₀ ). Во время этих ранних обработок защиты не было. Обработка поли (I: C) в этом эксперименте, проведенная на 1, 2 или 3 день, обеспечивала защиту 50%, 83% и 100% соответственно (данные не показаны), что позволяет предположить, что для эффективной защиты требуется согласованный эффект иммуномодуляции поли (I: C) в сочетании с достаточным количеством вирусных антигенов.

Обсуждение

Успех искоренения оспы позволил постепенно прекратить всемирную кампанию вакцинации, что привело к постепенному увеличению доли незащищенного населения. Таким образом, в случае случайного или преднамеренного высвобождения VARV потребуется быстрое и эффективное лечение, которое могло бы быть своевременно предоставлено как можно большему количеству людей. Оспа у людей связана с длительным инкубационным периодом (7–17 дней при естественных инфекциях), что дает время для p.е. вакцинация или лечение. Основываясь на нашем опыте на мышах, чем дольше инкубационный период, тем лучше эффект лечения и темпы выздоровления [8].

В этом отчете мы представили эффект агонистов TLR на терапевтическое окно п.э. вакцинация против оспы у мышей. После инфекции врожденная иммунная система обеспечивает хозяину первую линию защиты, за которой следует адаптивный иммунный ответ. Этот быстрый врожденный ответ объясняется, среди прочего, обнаружением чужеродных компонентов TLR, что приводит к активации различных путей, включая противовирусный иммунитет, стимуляцию Т-клеток и усиление сигналов воспаления [15], [17].Поксвирусы разработали множество стратегий для подрыва / вмешательства в иммунный ответ хозяина (обзор [37]). Недавно мы показали, что активная вакцинация до 3 дней р.э. обеспечивают эффективную защиту, требующую использования высокой дозы вакцины (1 × 10 ⁸ БОЕ у мышей) [8]. Это исследование также продемонстрировало, что, хотя это и не требуется, путь IFN типа I (передача сигналов IFNAR) играет роль в защите от p.e путем вакцинации. Кроме того, Самуэльсон и ее коллеги продемонстрировали, что TLR9 не требуется, но играет роль в p.е. защита с помощью активной вакцинации против ECTV [36].

Эти факты побудили нас изучить влияние на иммунный ответ активации двух TLR; TLR3 и TLR9 с использованием их синтетических агонистов (синтетических молекул двухцепочечной РНК и бактериальной ДНК CpG соответственно). В то время как адъюванты обычно добавляют к инактивированным или субъединичным вакцинам для придания предэкспозиционного иммунитета [32], [45] — [47], в настоящем исследовании мы вводили адъювант совместно с живой вакциной и исследовали его как терапевтическое средство. .е. лечение. Действительно, однократная обработка VACV-Lister и поли (I: C) обеспечила надежную защиту даже на 5-й день после операции. в то время как лечение только VACV-Lister (при обычной низкой дозе вакцины) было эффективным только до 1 дня p.e. (Таблица 1, [8]). В текущем исследовании агонист TLR3 Poly (I: C) обеспечивает лучшую защиту, чем агонисты TLR9. Это может отражать главную роль TLR3 в защите от ECTV и / или более высокую эффективность поли (I: C) по сравнению с ODN в активации иммунного ответа.Поксвирусы кодируют множество иммуномодуляторов, которые, как известно, мешают противовирусному иммунному ответу [37]. Мы не рассматривали вопрос о том, подавляется ли противовирусный иммунный ответ после введения ДНК (ODN) механизмами уклонения от иммунитета, кодируемыми ECTV, более эффективно, чем противовирусная активность, направленная против дцРНК.

После введения поли (I: C) была обнаружена глубокая активация ответа IFN типа 1 (IFNα) с последующей активацией гуморального и клеточного иммунитета.В значительной степени IFNα не индуцировался инфекцией ECTV, что позволяет предположить, что иммунное уклонение от ECTV может препятствовать индукции IFNα. Даже п.э. вакцинация VACV или MVA не приводила к активации IFNα, что еще раз подтверждает идею о том, что инфекция ECTV эффективно блокирует индукцию ответа IFN типа 1. Способность ECTV снижать уровень IFNα продемонстрирована на Фигуре 9B, показывающей, что отсрочка введения поли (I: C) с 3 по 5 день приводит к снижению ответа IFNα. Действительно, EVM166 из ECTV, ортолог B18R растворимого IFN-связывающего белка типа 1, эффективно связывает и исключает мышиный IFN типа 1 из кровотока, что способствует вирулентности ECTV [48].В дополнение к ECTV, вакцинные штаммы (Lister и MVA), использованные в этом исследовании, также кодируют ортологи B18R, однако в p.e. В сценарии вакцинации эффект B18, кодируемого VACV-Lister или MVA, вероятно, маскируется EVM166. Ранее мы продемонстрировали путем вакцинации мышей с нокаутом IFNAR [8], что в отсутствие рецептора IFN α / β вакцинация MVA является защитной, но мыши теряют больше веса, чем родительский штамм (C57BL / 6j), что указывает на то, что при По крайней мере, MVA может вызывать защитный ответ IFN типа 1, даже если EVM166 функционирует.В настоящем исследовании п.э. вакцинация VACV-Lister или MVA в сочетании с поли (I: C) не могла ослабить иммуносупрессию, вызванную ECTV на поздних стадиях заболевания. (Рисунок 9 B). Это ясно демонстрирует преимущество совместно вводимого поли (I: C), которое даже на поздних стадиях заболевания (например, 5-й день) индуцирует достаточное количество IFNα, которое ускользает от связывания вирусных IFN-связывающих белков и составляет защитный иммунитет. В дополнение к растворимым IFN-связывающим белкам поксвирусы кодируют множество белков, которые мешают пути IFN на нескольких уровнях, что может эффективно мешать IFN-ответу 1 типа [37].

Интересно, что умирающие мыши с высокой вирусной нагрузкой в ​​легких, селезенке и печени, которые в конечном итоге умирают от инфекции, имели значительно более высокий уровень сывороточного IFNγ, чем мыши, которые получали защитную терапию (поли (I: C) +/- вакцина; рисунки 3-5 ). Секреция IFNγ, в основном активированными NK- и T-клетками, выполняет иммунорегулирующие функции, включая активацию макрофагов и нейтрофилов, усиление активности уничтожения NK-клеток, регуляцию B- и T-клеточного ответа на антигены, стимуляцию специфических цитотоксических T-клеток, продвижение хемокина. и экспрессия цитокинов, а также вклад в защиту от вирусного патогенеза [49] — [51].Действительно, воздействие вируса, которое обеспечивает защитный иммунитет (например, воздействие кожного поксвируса у мышей), приводит к временной индукции ответа IFNγ [7], [52]. Однако при интраназальном летальном воздействии устойчивый и устойчивый ответ IFNγ выявляется на поздних стадиях заболевания, коррелирующих с патологическим повреждением тканей и смертью. Эта высокая концентрация IFNγ оказывает ингибирующее действие на адаптивный иммунный ответ [43], [44], что демонстрируется значительным ингибированием продукции IgM (рис. 7).Действительно, феномен высокой концентрации IFNγ, связанный с патологическим повреждением тканей на поздних стадиях заболевания, называемый «цитокиновый шторм», был описан Jahrling et al. у приматов, инфицированных VARV [42]. Линейная корреляция между повышенным уровнем сывороточного IFNγ и вирусной нагрузкой была продемонстрирована также у мышей, инфицированных RSV [53], что дополнительно указывает на то, что индуцированный IFNγ ответ может быть связан либо с защитным иммунитетом, либо с иммунной патологией в зависимости от времени и контекста заболевания.Holechek et. al. [54] недавно сообщил, что п.э. вакцинация с помощью VACV, экспрессирующего IFNγ, защищает мышей от инфекции VACV и ECTV и приписывает защиту ранней экспрессии мышиного IFNγ, как обсуждалось выше. Поскольку явная поздняя экспрессия IFNγ может быть патологической, в то время как ранняя экспрессия имеет защитное значение, терапевтическое использование IFNγ следует рассматривать с использованием моделей временного, а не конститутивного дефицита IFNγ. На основании данных, представленных в этой работе, будет интересно оценить рекомбинантный вирус осповакцины, экспрессирующий IFNα в качестве внутреннего адъюванта для p.е. лечение, которое недавно было проведено с IFNγ. Эффективность лечения повторяющимися дозами IFNα и IFNγ против вирусов осповакцины и оспы обезьян у мышей дополнительно указывает на терапевтический потенциал модуляции иммунного ответа при лечении ортопоксвирусных инфекций [49], [55].

После защитного лечения (поли (I: C) +/- вакцина) вирусная нагрузка в селезенке и печени была значительно снижена на 8 день по сравнению с незащищенными мышами. Однако при сравнении легких не было обнаружено статистически значимой разницы между группами, независимо от эффективности лечения, что позволяет предположить, что выведение вируса из легких на более поздних стадиях заболевания не является прямым результатом противовирусной активности IFNα, а скорее достигается защита. иммуномодулирующими эффектами IFNα и других иммунных медиаторов / клеток, что в некоторой степени аналогично тому, что сообщалось Holechek et.al. [54]. Поскольку нет данных, свидетельствующих об устойчивой репликации ECTV в легких после выздоровления, мы неинвазивно контролировали уровень ECTV с 8-го по 16-й день. с использованием вирулентного ECTV-Luc. Действительно, выздоровление было связано с клиренсом вируса из печени и селезенки, в то время как низкий уровень ECTV легких все еще обнаруживался даже через 16 дней р.э. у мышей, которые в остальном выглядели здоровыми. Таким образом, удаление вируса из легких не является предпосылкой для выздоровления, и лежащий в основе механизм, позволяющий выздороветь, в то время как жизнеспособные вирусы все еще существуют в легких, требует дальнейшего уточнения.Пока неизвестно, способствует ли постепенный контроль вируса в легких выздоровлению, поскольку известно, что устойчивый противовирусный ответ имеет патологические последствия, или же иммунный ответ не может обеспечить быстрое удаление вируса в легких, в отличие от селезенки и печени.

Клеточный иммунный ответ в селезенке через 8 дней р.е. различается у мышей, получавших поли (I: C) или оставленных без лечения. Введение поли (I: C) было связано с большим количеством NK-клеток и скоординированной активацией NK и T-клеток (CD8 ⁺ и CD4 ⁺ ), что в сочетании с активацией продукции антител IgM коррелировало с улучшенной защитой.Инфицированные и необработанные мыши показали глубокую активацию клеток-киллеров CD8 ⁺ , в то время как как CD4 ⁺ , так и NK-клетки были слабо активными, что указывает на несбалансированный иммунный ответ, в отличие от мышей, которым вводили поли (I: C) с или без вакцина. В то время как активированные клетки CD8 ⁺ необходимы для защиты путем предэкспозиционной вакцинации VACV против летальной поксвирусной инфекции [40], [56], [57], скоординированная активация дополнительных клеток (например, NK и CD4 ⁺ Т-клеток ) должно быть важным в регулировании ответа.Сильное повышение уровней IFNγ в сыворотке незащищенных животных является четким признаком иммунной патологии, а не иммунной защиты, как ранее было показано для инфекции VARV у нечеловеческих приматов [42].

Ранее было продемонстрировано, что у мышей с дефицитом В-клеток вакцинация MVA за 2 дня до контакта обеспечивала быструю защиту [40]. Точно так же предэкспозиционная вакцинация мышей с дефицитом В-клеток с помощью VACV-Lister обеспечивала защиту от летального интраназального воздействия ECTV (наши неопубликованные данные), предполагая, что выработка антител не является существенной для быстрой защиты или предварительного воздействия от ECTV-инфекции.Однако п.э. иммунизация либо VACV-Lister, либо MVA не была защитной у мышей с дефицитом B-клеток (наши неопубликованные данные), указывая на важную роль B-клеток в p.e. сценарий. Основываясь на корреляции между производством IgM и выживаемостью и плейотропными эффектами поли (I: C), которые приводят к активации различных иммунных клеток, остается выяснить, будет ли поли (I: C) вызывать защитный иммунный ответ в организме человека. отсутствие В- или Т-клеток.

Предэкспозиционная иммунизация VACV-Lister или MVA и даже быстрая иммунизация MVA [40], [58] индуцируют устойчивый вирус-специфический иммунный ответ CD8 +, необходимый для защиты от инфекции ECTV.Интересно, что через 6 дней после летального интраназального воздействия ECTV на мышей C57BL / 6 невакцинированные мыши демонстрируют устойчивый вирус-специфический ответ CD8 + (B8R _20–27 ), но позже его состояние ухудшается и умирает от инфекции (наши неопубликованные данные). В этот момент их CTL-ответ напоминает ответ после защитной вакцинации, предполагая, что, хотя CTL-ответ необходим для защиты, сложный и несбалансированный иммунный ответ после воздействия не в состоянии защитить, даже если первоначально был индуцирован вирус-специфический CTL-ответ.Включает ли механизм защиты, обеспечиваемый поли (I: C), также повышенное количество вирус-специфичных CD8 + -клеток на ранней стадии pe, активацию модифицированного репертуара эпитоп-специфичных CD8 + -клеток или модуляцию иммунного ответа, включая активацию вирус-специфических CD4 + -клеток и модуляцию. других типов Т-клеток (например, Th27 и T-reg) еще предстоит выяснить.

Наши данные указывают на важность выбора времени для единой схемы лечения. В то время как п.э. введение поли (I: C) (дни 3-5) эффективно индуцировало секрецию IFNα и защищало от инфекции ECTV, до воздействия или даже кратковременного (до 1 дня).e.) введение индуцировало секрецию IFNα, но не могло обеспечить защиту, что подчеркивает необходимость вирусных антигенов для достижения защиты. Ранее мы продемонстрировали, что в п.э. При вакцинации антигенная масса вакцины определяет эффективность защиты [8]. Мы показали, что п.э. введение адъюванта поли (I: C) (до +4 дня у мышей BALB / c) позволяет достичь защитного иммунитета без необходимости проведения вакцинации высокими дозами. Если не вводить одновременно с вакциной, эффективность введения поли (I: C) зависит от антигенной массы инфицирующего вируса (ECTV), как обсуждалось выше.Однако на более поздних стадиях заболевания (День +5) мы предполагаем, что для достижения достаточной защиты требовалось совместное введение вакцины, поскольку на этой стадии болезни механизмы уклонения иммунной системы препятствуют способности поли (I: C) проявлять активность. его вспомогательная роль. Это было продемонстрировано сниженной способностью поли (I: C) индуцировать IFNα на поздних стадиях заболевания (рис. 9 B).

При переводе на человека из-за длительного инкубационного периода оспы в случае р.э. кольцевая вакцинация, будет неясно, кто и когда подвергся заражению.В результате невозможно определить «терапевтическое окно только адъюванта», что требует совместного введения вакцины для достижения защиты в смешанной популяции, состоящей из подвергшихся воздействию, подозреваемых и наивных людей. Подобный феномен, при котором некоторые виды лечения, назначенные в первый день, были менее эффективными по сравнению с лечениями, назначенными позже, было продемонстрировано для р.э. терапия цидофовиром (CDV) и CMX001 [7], [10]. Сниженная эффективность CDV в первые дни объясняется его быстрым выведением из кровотока, что приводит к недоступности препарата на поздних стадиях заболевания.Подобно поли (I: C), однократное лечение CDV было наиболее эффективным, если оно проводилось не ранее 2-го дня до 5 или 7 дня (в зависимости от дозы). Как и в случае с CDV, предварительные эксперименты по повторяющимся обработкам поли (I: C), направленные на повышение биодоступности поли (I: C), показали многообещающие результаты (неопубликованные данные).

Эффективность п.э. введение адъювантов при оспе человека неизвестно, однако ожидается, что более длительный инкубационный период по сравнению с оспой мышей приведет к сопоставимым показателям защиты.Этот подход может иметь потенциальные последствия также для традиционной предконтактной вакцинации против оспы. Два типа вакцин, используемых в нашей работе (VACV-Lister и MVA), известны своей высокой эффективностью. VACV-Lister была одной из вакцин, используемых во всем мире для искоренения оспы, а MVA — это современная высокоаттенуированная вакцина, которая должна иметь меньше поствакцинальных побочных эффектов из-за ее плохой способности реплицироваться в млекопитающих-хозяевах. Одним из недостатков MVA является необходимая доза (первичная и повышающая, каждая 1 × 10 ⁸ БОЕ), которая значительно выше, чем разовая доза VACV-Lister (1 × 10 ⁶ БОЕ).Добавление адъюванта, такого как поли (I: C) или CpG-ODN, может улучшить эффективность вакцинации и может позволить достичь сопоставимой защиты при сниженной дозе вакцины. Применение той же стратегии для VACV-Lister может снизить вероятность или тяжесть поствакцинальных осложнений, а в случае MVA может изменить протокол на однократную вакцинацию (без необходимости повторной вакцинации) или снизить дозу вакцинации (т. Е. 1 × 10 ⁶ вместо 1 × 10 ⁸ БОЕ). Если вакцинация уменьшенными дозами окажется эффективной, это упростит массовое производство MVA.В настоящее время изучается сравнение традиционных режимов и предлагаемых с добавлением адъювантов.

В заключение, адъюванты на основе синтетической РНК и ДНК, вводимые в сочетании с противооспенными вакцинами, VACV-Lister или MVA, значительно улучшили эффективность p.e. защита по сравнению с одними вакцинами. Благоприятный эффект адъюванта РНК, поли (I: C), наблюдался даже без совместной вакцинации, но только до определенного момента времени. Повышенная защита была связана с ускоренными гуморальными и клеточными иммунными ответами и привела к предотвращению смертности, облегчению симптомов заболевания и снижению вирусной нагрузки в органах-мишенях.Этот новый подход комбинирования адъювантов с живой вакциной в р.э. режим потенциально может быть использован при других вирусных заболеваниях, при которых р.э. лечение актуально.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Заболеваемость, основанная на изменении веса после лечения мышей C57BL / 6j после воздействия (п.в.). Мыши были инфицированы 2–3 i.n. ЭЦТВ ЛД ₅₀ . (A) Обработка поли (I: C) с или без VACV-Lister и только лечение VACV-Lister в день 0 p.е. (В). Обработка поли (I: C) с использованием VACV-Lister или MVA или без них, а также лечение только вакцинами в день 1 p.e. (C) Обработка поли (I: C) с или без MVA и только лечение MVA на 2 день p.e. Звездочка обозначает значительную разницу в площади под кривой изменения веса на протяжении всего эксперимента для обработанных групп по сравнению с инфицированной необработанной группой (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, * *** P <0,0001, t -тест). Показан сбор данных для каждого лечения (изменение веса (среднее, стандартное отклонение)).Смертность от общего количества мышей в каждой группе обозначена цветом рядом с легендой.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.s001

(TIF)

Рисунок S2.

Вирусная нагрузка после п.э. лечения. Вирусную нагрузку в печени (A), селезенке (B) и (C) легких (C) мышей C57BL / 6j определяли с помощью анализа бляшек. Органы были проанализированы через 8 дней после заражения 2 i.n. ЭЦТВ ЛД ₅₀ . Мышей лечили в дни 0–2 p.e. как указано.Горизонтальные линии представляют собой среднее геометрическое для каждой группы. Обозначены выживаемость каждой группы. Звездочка означает значительное снижение вирусной нагрузки (n = 3 в каждой обработанной группе) по сравнению с инфицированной необработанной группой (n = 6, P <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.s002

(TIF)

Рисунок S3.

Облегчение повреждений селезенки с помощью поли (I: C) лечения. Селезенки брали у мышей через 8 дней р.э. лечился на 3-й день.(A, B) Окраска гематоксилином и эозином (H&E). (C, D) Окраска против осповакцины для обнаружения ECTV (положительная окраска коричневого цвета). (E, F) CD45 для окрашивания лейкоцитов (положительное окрашивание коричневым цветом). Рисунки B, D и F являются увеличенными рамками, представленными в A, C и E соответственно. Увеличение изображений A, C, E: X40; B, D, F: X1000.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.s003

(TIF)

Рисунок S4.

Влияние обработки поли (I: C) на печень мышей, инфицированных ECTV. Печень была взята у мышей через 8 дней р.э. обработанных поли (I: C) на 3-й день (A – F), инфицированных необработанных (G – H) или незараженных наивных мышей (I – J). Левая колонка — гематоксилин, эозин и краситель (H&E), правая колонка — окраска против коровьей оспы для обнаружения ECTV (положительная окраска коричневого цвета). Последовательные участки (A, B) поли (I: C) и лечения VACV-Lister; (C, D) обработка поли (I: C) и (E, F) обработка VACV-Lister. Увеличение на всех изображениях: X40.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0110545.s004

(TIF)

Благодарности

Мы хотим поблагодарить профессора Луиса Сигала, Исследовательский институт онкологического центра Fox Chase, Филадельфия, за предоставление ECTV-Luc. Благодарим г-жу Паулу Шнайдер за прекрасного технического ассистента. Мы благодарим г-на Бени Шареаби, г-на Шломи Авраама и г-на Йоси Шломовича за животноводство. Мы благодарим доктора Ари Ордентлиха, доктора Авигдора Шаффермана, доктора Шмуэля Ицхаки и профессора Шмуэля Шапиру за плодотворные обсуждения и поддержку. Мы хотим поблагодарить проф.Клаусу Чихутеку, доктору Михаэлю Мюленбаху и доктору Ясемин Зуэзер (PEI, Германия) за плодотворные обсуждения.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: TI SM HA NE SL NP. Проведены эксперименты: ТИ СМ ГА НЭ БП СЛ НП. Проанализированы данные: TI SM HA NE TW NP. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: BP TW. Участвовал в написании рукописи: TI SM HA NE TW SL NP.

Ссылки

1. 1. Феннер Ф. (1982) Успешная кампания по искоренению.Глобальная ликвидация оспы. Rev Infect Dis 4: 916–930.
2. 2. Хендерсон Д.А. (1999) Надвигающаяся угроза биотерроризма. Science 283: 1279–1282.
3. 3. Мортимер П.П. (2003) Может ли вакцинация против оспы быть успешной? Clin Infect Dis 36: 622–629.
4. 4. Кросс Дж. (1821) История разнообразной эпидемии, которая произошла в Норвиче в 1819 году и унесла жизни 530 человек; с оценкой защиты, обеспечиваемой вакцинацией, и обзором прошлых и настоящих мнений по ветряной оспе и модифицированной оспе.; Дж. Э. М., редактор.
5. 5. Эстебан Д., Паркер С., Шривер Дж., Хартцлер Х., Буллер Р.М. (2012) Мышиная оспа, модель оспы на мелких животных. Методы Мол Биол 890: 177–198.
6. 6. Эстебан Д. Д., Буллер Р. М. (2005) Вирус эктромелии: возбудитель оспы мышей. J Gen Virol 86: 2645–2659.
7. 7. Исраэли Т., Паран Н., Лустиг С., Эрез Н., Полити Б. и др. (2012) Одно лечение цидофовиром спасает животных на прогрессирующих стадиях летальной ортопоксвирусной болезни.Virol J 9: 119
8. 8. Paran N, Suezer Y, Lustig S, Israely T., Schwantes A, et al. (2009) Иммунизация после контакта модифицированным вирусом осповакцины Анкара или обычной вакциной Lister обеспечивает надежную защиту на мышиной модели оспы человека. J Infect Dis 199: 39–48.
9. 9. Stabenow J, Buller RM, Schriewer J, West C., Sagartz JE, et al. (2010) Мышиная модель летальной инфекции для оценки профилактических и терапевтических средств против вируса оспы обезьян. J Virol 84: 3909–3920.
10. 10. Паркер С., Тушетт Э., Оберле С., Алмонд М., Робертсон А. и др. (2008) Эффективность терапевтического вмешательства с пероральным эфирно-липидным аналогом цидофовира (CMX001) на летальной модели оспы мышей. Antiviral Res 77: 39–49.
11. 11. Quenelle DC, Buller RM, Parker S, Keith KA, Hruby DE, et al. (2007) Эффективность отсроченного лечения ST-246, вводимого перорально, против системных ортопоксвирусных инфекций у мышей. Антимикробные агенты Chemother 51: 689–695.
12. 12.Лустиг С., Майк-Рахлин Г., Паран Н., Меламед С., Исраэли Т. и др. (2009) Эффективная постконтактная защита от летальной инфекции ортопоксвирусов иммуноглобулином осповакцины включает индукцию адаптивного иммунного ответа. Vaccine 27: 1691–1699.
13. 13. Рид С.Г., Орр М.Т., Фокс С.Б. (2013) Ключевые роли адъювантов в современных вакцинах. Нат Мед 19: 1597–1608.
14. 14. Каваи Т., Акира С. (2010) Роль рецепторов распознавания образов в врожденном иммунитете: обновленная информация о Toll-подобных рецепторах.Нат Иммунол 11: 373–384.
15. 15. Сасай М., Ямамото М. (2013) Рецепторы распознавания патогенов: лиганды и пути передачи сигналов с помощью Toll-подобных рецепторов. Int Rev Immunol 32: 116–133.
16. 16. Лестер С.Н., Ли К. (2014) Толл-подобные рецепторы в противовирусном врожденном иммунитете. J Mol Biol 426: 1246–1264.
17. 17. Arpaia N, Barton GM (2011) Толл-подобные рецепторы: ключевые участники противовирусного иммунитета. Curr Opin Virol 1: 447–454.
18. 18. Hanagata N (2012) Структурно-зависимый иммуностимулирующий эффект олигодезоксинуклеотидов CpG и их системы доставки.Int J Nanomedicine 7: 2181–2195.
19. 19. Вилайсане А., Муруве Д.А. (2009) Врожденный иммунный ответ на ДНК. Семин Иммунол 21: 208–214.
20. 20. Matsumoto M, Seya T (2008) TLR3: индукция интерферона двухцепочечной РНК, включая поли (I: C). Adv Drug Deliv Rev. 60: 805–812.
21. 21. Tatematsu M, Seya T, Matsumoto M (2014) Помимо дцРНК: передача сигналов Toll-подобного рецептора 3 в РНК-индуцированных иммунных ответах. Biochem J 458: 195–201.
22. 22.Zhang SY, Herman M, Ciancanelli MJ, Perez de Diego R, Sancho-Shimizu V, et al. (2013) Иммунитет TLR3 к инфекции у мышей и людей. Curr Opin Immunol 25: 19–33.
23. 23. Steinhagen F, Kinjo T, Bode C, Klinman DM (2011) Иммунные адъюванты на основе TLR. Vaccine 29: 3341–3355.
24. 24. Lau YF, Tang LH, Ooi EE (2009) Лиганд TLR3, который демонстрирует сильное ингибирование репликации вируса гриппа и обладает сильной адъювантной активностью, имеет потенциал для двойного применения при пандемии гриппа.Vaccine 27: 1354–1364.
25. 25. Шталь-Хенниг С., Айзенблаттер М., Ясни Э., Рзехак Т., Теннер-Рач К. и др. (2009) Синтетические двухцепочечные РНК являются адъювантами для индукции Т-хелпера 1 и гуморального иммунного ответа на вирус папилломы человека у макак-резусов. PLoS Pathog 5: e1000373.
26. 26. Skountzou I, Martin Mdel P, Wang B, Ye L, Koutsonanos D, et al. (2010) Флагеллины сальмонеллы являются мощными адъювантами для интраназально вводимой цельной инактивированной вакцины против гриппа.Vaccine 28: 4103–4112.
27. 27. Тейлор Д. Н., Тринор Дж. Дж., Страут С., Джонсон С., Фицджеральд Т. и др. (2011) Индукция сильного иммунного ответа у пожилых людей с использованием агониста TLR-5, флагеллина, с рекомбинантной гибридной вакциной гемагглютинин гриппа-флагеллин (VAX125, STF2.HA1 SI). Vaccine 29: 4897–4902.
28. 28. Coban C, Horii T, Akira S, Ishii KJ (2010) TLR9 и эндогенные адъюванты вакцины против малярии на стадии цельной крови. Expert Rev Vaccines 9: 775–784.
29. 29. Туган Т., Аоши Т., Кобан С., Катакай Ю., Кай С. и др. (2013) Адъюванты TLR9 повышают иммуногенность и защитную эффективность вакцины против малярии SE36 / AHG на моделях приматов, отличных от человека. Hum Vaccin Immunother 9.
30. 30. Kundi M (2007) Новая вакцина против гепатита B с улучшенной адъювантной системой. Expert Rev Vaccines 6: 133–140.
31. 31. Didierlaurent AM, Morel S, Lockman L, Giannini SL, Bisteau M и др. (2009) AS04, адъювантная система на основе солей алюминия и агонистов TLR4, индуцирует временный локализованный врожденный иммунный ответ, ведущий к усилению адаптивного иммунитета.J Immunol 183: 6186-6197.
32. 32. Xiao Y, Aldaz-Carroll L, Ortiz AM, Whitbeck JC, Alexander E, et al. (2007) Вакцина против оспы на основе белка защищает мышей от заражения вирусом осповакцины и эктромелии при введении в качестве первичной и однократной иммунизации. Vaccine 25: 1214–1224.
33. 33. Fogg CN, Americo JL, Lustig S, Huggins JW, Smith SK и др. (2007) Усиленные адъювантом ответы антител на рекомбинантные белки коррелируют с защитой мышей и обезьян от проблем с ортопоксвирусами.Vaccine 25: 2787–2799.
34. 34. Golden JW, Josleyn M, Mucker EM, Hung CF, Loudon PT и др. (2012) Параллельное сравнение генной вакцины против оспы с MVA у нечеловеческих приматов. PLoS One 7: e42353.
35. 35. Knopf HL, Blacklow NR, Glassman MI, Cline WL, Wong VG (1971) Антитело в слезах после интраназальной вакцинации инактивированным вирусом. II. Повышение выработки антител к слезе за счет использования полиинозиновой: полицитидиловой кислоты (поли I: C). Инвестируйте офтальмол 10: 750–759.
36. 36. Самуэльссон С., Хаусманн Дж., Лаутербах Х., Шмидт М., Акира С. и др. (2008) Выживание мышей после летальной поксвирусной инфекции зависит от TLR9, а терапевтическая вакцинация обеспечивает защиту. Дж. Клин Инвест 118: 1776–1784.
37. 37. Смит Г.Л., Бенфилд С.Т., Малукер де Мотес С., Маццон М., Эмбер С.В. и др. (2013) Иммунное уклонение от вируса осповакцины: механизмы, вирулентность и иммуногенность. J Gen Virol 94: 2367–2392.
38. 38. Xu RH, Rubio D, Roscoe F, Krouse TE, Truckenmiller ME и др.(2012) Ингибирование антителами рецептора-ловушки интерферона 1-го типа излечивает вирусное заболевание путем восстановления передачи сигналов интерферона в печени. PLoS Pathog 8: e1002475.
39. 39. Паран Н., Лустиг С., Цви А., Эрез Н., Исраели Т. и др. (2013) Активная вакцинация вирусом осповакцины А33 защищает мышей от летальных вирусов осповакцины и эктромелии, но не от вируса коровьей оспы; выяснение специфического адаптивного иммунного ответа. Вирол Дж 10: 229.
40. 40. Кремер М., Суэцер Ю., Фольц А., Френц Т., Майзуб М. и др.(2012) Критическая роль перфорин-зависимого CD8 + Т-клеточного иммунитета для быстрой защитной вакцинации на мышиной модели оспы человека. PLoS Pathog 8: e1002557.
41. 41. Рид LJ, Muench H (1938) Простой метод оценки пятидесятипроцентной конечной точки. Am J Hyg 493–497.
42. 42. Ярлинг П.Б., Хенсли Л.Е., Мартинес М.Дж., Ледук Дж.В., Рубинс К.Х. и др. (2004) Изучение возможности инфицирования вирусом натуральной оспы макак яванского макака в качестве модели оспы человека. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 15196–15200.
43. 43. Хурадо А, Карбаллидо Дж., Гриффель Х., Хохкеппель Х.К., Ветцель Г.Д. (1989) Иммуномодулирующие эффекты гамма-интерферона на ответы зрелых В-лимфоцитов. Experientia 45: 521–526.
44. 44. Reynolds DS, Boom WH, Abbas AK (1987) Ингибирование активации B-лимфоцитов интерфероном-гамма. J Immunol 139: 767–773.
45. 45. Buchman GW, Cohen ME, Xiao Y, Richardson-Harman N, Silvera P, et al. (2010) Вакцина против оспы на основе белка защищает нечеловекообразных приматов от заражения вирусом оспы обезьян.Vaccine 28: 6627–6636.
46. 46. Ичинохе Т., Ватанабэ И., Ито С., Фуджи Х., Морияма М. и др. (2005) Синтетическая двухцепочечная РНК поли (I: C) в сочетании с вакциной для слизистых оболочек защищает от инфекции вирусом гриппа. J Virol 79: 2910–2919.
47. 47. Сяо Й, Цзэн Й, Александр Э, Мехта С., Джоши С.Б. и др. (2013) Адсорбция рекомбинантного белка L1 поксвируса на гидроксид алюминия / адъюванты вакцины CpG усиливает иммунные ответы и защиту мышей от заражения вирусом осповакцины.Vaccine 31: 319–326.
48. 48. Xu RH, Cohen M, Tang Y, Lazear E, Whitbeck JC и др. (2008) IFN-связывающий белок ортопоксвируса типа I важен для вирулентности и является эффективной мишенью для вакцинации. J Exp Med 205: 981–992.
49. 49. Лю Джи, Чжай Кью, Шаффнер Д.Д., Ву А., Йоханнес А. и др. (2004) Профилактика летальных респираторных инфекций, вызванных осповакциной, у мышей с помощью интерферона-альфа и интерферона-гамма. FEMS Immunol Med Microbiol 40: 201–206.
50. 50.Muller U, Steinhoff U, Reis LF, Hemmi S, Pavlovic J, et al. (1994) Функциональная роль интерферонов типа I и типа II в противовирусной защите. Наука 264: 1918–1921.
51. 51. Ramshaw I, Ruby J, Ramsay A, Ada G, Karupiah G (1992) Экспрессия цитокинов рекомбинантными вирусами осповакцины: модель для изучения цитокинов при вирусных инфекциях in vivo. Immunol Rev 127: 157–182.
52. 52. Леви HB, Львовский E (1978) Местное лечение инфекции вируса коровьей оспы с индуктором интерферона у кроликов.J Infect Dis 137: 78–81.
53. 53. Walsh KB, Teijaro JR, Brock LG, Fremgen DM, Collins PL, et al .. (2014) Животная модель респираторно-синцитиального вируса: CD8 + Т-клетки вызывают цитокиновый шторм, который химически устраняется терапией агонистом рецептора сфингозин-1-фосфат-1. J Virol.
54. 54. Холечек С.А., Дензлер К.Л., Хек М.К., Шривер Дж., Буллер Р.М. и др. (2013) Использование рекомбинантного вируса коровьей оспы, экспрессирующего гамма-интерферон, для защиты от вирусов коровьей оспы и эктромелии после контакта.PLoS One 8: e77879.
55. 55. Earl PL, Americo JL, Moss B (2012) Смертельная инфекция вирусом оспы обезьян у мышей CAST / EiJ связана с недостаточным ответом на гамма-интерферон. J Virol 86: 9105–9112.
56. 56. Беляков И.М., Граф П., Дзуцев А., Кузнецов В.А., Лимон М. и др. (2003) Общие способы защиты от поксвирусной инфекции аттенуированными и обычными вирусами противооспенной вакцины. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 9458–9463.
57. 57. Goulding J, Bogue R, Tahiliani V, Croft M, Salek-Ardakani S (2012) Т-клетки CD8 необходимы для выздоровления от респираторной инфекции вируса осповакцины.J Immunol 189: 2432–2440.
58. 58. Volz A, Langenmayer M, Jany S, Kalinke U, Sutter G (2014) Быстрое распространение CD8 + T-клеток у мышей с дефицитом рецептора интерферона дикого типа и типа I коррелирует с защитой после экстренной иммунизации низкими дозами модифицированным вирусом осповакцины Анкара. J Virol.